碧芯生物助力小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）的获得及鉴定

有网友碰到这样的问题“碧芯生物助力小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）的获得及鉴定”。小编为您整理了以下解决方案，希望对您有帮助：

解决方案1：

树突状细胞（Dendritic cells, DCs）在免疫反应中扮演关键角色，通过主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递抗原肽以激活T细胞，从而启动适应性免疫反应。DCs还分泌细胞因子和生长因子，以增强并调节免疫反应。此外，DCs在激活Naive T细胞、引导效应性T细胞分化以及T细胞耐受性发展中起着核心作用。由于DCs在体内多种组织中含量稀少，难以满足科研与临床需求，学者们致力于体外培养和扩增DCs。对于人DCs，最常用方法是从人外周血单个核细胞（PBMCs）诱导产生；而对于小鼠，通常从骨髓细胞诱导产生，即骨髓来源的DCs（BMDCs）。

为了获取更高数量和纯度的BMDCs，碧芯生物提供了海南医学院张老师分享的经典制备方法（Lu, Zhang et al., 2021）。该方法不仅简化了流程，而且通过明确列出所用试剂的品牌及货号，为用户提供了直接可操作的指南，从而优化了BMDCs的制备质量。接下来，我们将详细阐述BMDCs的制备过程。

首先，准备所需试剂：取10 mL胎牛血清（Gibco，货号：1932597）加入90 mL RMPI 10培养基（博士德，货号：PYG0066），再加入β-巯基乙醇（Amresco，货号：0482），使其终浓度达到50 µM。具体步骤如下：取10 µL β-巯基乙醇加入到1 mL PBS（博士德，货号：PYG0021），混匀后从中取出34 µL，加入至上述的100 mL培养基中。同时，准备GM-CSF（abcam，货号：ab9742），配制成2 µg/mL的溶液，并分装保存在-80 oC。

接着，制备BMDCs：取C57bl/6j小鼠，进行颈椎脱臼法处死，然后在消毒酒精中浸泡2分钟。在超净工作台中，手术取出所有股骨和胫骨，并去除骨周围的肌肉组织。将骨移入6孔细胞培养板中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨完全变白。收集骨髓悬液，通过45微米细胞过滤网过滤后，用PBS洗涤并分散细胞，1000 g离心3分钟，弃上清。接着加入红细胞裂解液，轻轻吹打分散细胞，1分钟后离心3分钟，弃上清。使用PBS洗涤，最终用2 mL BMDCs培养基分散细胞，并转移至直径为90 mm细菌培养皿中，补入6 mL BMDCs培养基，并加入80 µL预先配好的GM-CSF溶液（2 µg/mL），使终浓度达到20 ng/mL，于二氧化碳培养箱中培养48小时。

48小时后，继续加入8 mL BMDCs培养基及80 µL GM-CSF（2 µg/mL），培养至72小时。72小时后，换液并加入80 µL GM-CSF（2 µg/mL）。上清中的细胞不丢弃，将上清转移至15 mL无菌离心管中，1000 g离心3分钟，弃上清。细胞用8 mL BMDCs培养基分散，测定细胞浓度，并接种在细胞培养板上。此步骤获得的BMDC细胞为未成熟的DC细胞。24小时后，加入LPS（Sigma， SMB00610）刺激，即可获得成熟的BMDCs细胞。

最后，鉴定BMDCs：通过荧光标记的CD11c以及CD80、CD86染色，再用流式细胞技术，通过CD11c阳性细胞的比例明确BMDCs的纯度，通过CD80、CD86双阳的比例明确成熟BMDCs的比例。此外，对比无药物刺激与LPS刺激BMDCs 24 h后，细胞培养上清中IL-6、TNF-ɑ、MCP-1等细胞因子表达水平的变化，可以确定BMDCs是否成功获取以及成熟状态。采用碧芯生物科技有限公司的Beadstar-mPlexTM小鼠多细胞因子检测试剂盒（货号：BS-MC01），可以一次检测多个细胞因子的含量，同时使用流式细胞技术，只需25 µL样本，即可同时检测IL-6、TNF-ɑ、MCP-1等多个细胞因子的浓度。通过实验，可以直观地观察到无药物刺激与LPS刺激DC细胞24 h后，细胞上清液中IL-6、TNF-ɑ、MCP-1的浓度变化。