维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽医科大学学报Ａｃｔ８ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２００６ Ｏｃｔ；４１（５） ’４９１・ 人白细胞介素１５基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 罗欣，徐从贞，方敏，张胜权 摘要 目的克隆人白细胞介素（ＩＬ）１５全长ｃＤＮＡ，并在大 肠杆菌中表达。方法从人外周血分离的淋巴细胞中提取 总ＲＮＡ，通过ＲＴ—ＰＣＲ扩增出ｈｌＬ一１５全长ｃＤＮＡ。构建到原 核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）中，通过卡那霉素平板筛选及ＰＣＲ 鉴定，挑出阳性克隆进行扩增，ＤＮＡ测序正确后，转化到大 肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，扩增后ＩＰＴＧ诱导表达。通过ＳＤＳ－ ＰＡＥＧ及Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ方法鉴定表达的融合蛋白。结果成 功构建人ＩＬ．１５表达载体，并表达于大肠杆菌中。ＳＤＳ—ＰＡＥＧ 及Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ分析显示表达的融合蛋白分子量为１６．１ ｋｕ， 与理论值相符。结论获得了ｈｌＬ一１５融合蛋白，为ｈｌＬ一１５ 单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。 主题词 白细胞介素１５／遗传学；大肠杆菌／遗传学；基因 表达；重组融合蛋白质类 中图分类号Ｒ ３４２；Ｒ ３７８．２１；Ｒ ３９２．１２；Ｒ ３９４；Ｒ ３４１．７； Ｒ ９７７．４ 文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２００６）【）５—０４９１—０３ 白细胞介素（ＩＬ）一１５是１９９４年由Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ０ｆ【ｌ 在检测猴肾内皮细胞株ＣＶ一１／ＥＢＮＡ的培养上 清液中发现并命名的。人ＩＬ一１５基因位于４ｑ３１，跨 度大约３４ｋｂ，含９个外显子。成熟的ｈｌＬ一１５由１１４ 个氨基酸组成。有两个二硫键和Ｃ末端两个糖基 化位点¨－２］。其组织来源丰富，许多类型细胞表达 ＩＬ一１５，但主要来源于外周血单核／巨噬细胞 。 本研究通过基因重组技术克隆并表达ｈＩＬ一１５， 希望在此基础上制备ｈｌＬ一１５的单克隆抗体 Ｊ，应用 于一些疾病诊断与治疗的研究 。 １材料与方法 １．１材料质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）、大肠杆菌ＪＭ１０９、 ＢＬ２１（ＤＥ３）为本室保存，ＰＣＲ引物由上海生工生物 工程技术服务有限公司合成。ＲＰＭＩ１６４０培养基购 自Ｇｉｂｃｏ公司。ＲＴ试剂盒、质粒提取试剂盒、ＤＮＡ ２００６—０５—２９接收 基金项目：安徽省自然科学基金资助（编号：０５０４３０６０４） 作者单位：安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室、化学与生 物化学实验中心，合肥２３００３２ 作者简介：罗欣，女，４＿４岁，实验师； 张胜权，男，３７岁，副教授，责任作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｇｑｕａｎｚｈａ ｎｇｌ＠ｓｉｎａ．ｅｏｍ 回收试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ＩＦＦＧ、高保真Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自 ＴａＫａＲａ公司。ＩＬ一１５单克隆抗体购自Ｒ＆Ｄ公司。 １．２方法 １．２．１外周血中淋巴细胞分离 通过淋巴细胞分 离液分离外周血中的单核细胞用于提取总ＲＮＡ。 １．２．２ ＲＴ—ＰＣＲ扩增ＩＬ一１５全长ｃＤＮＡ 向分离的 淋巴细胞中加入１ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ，按试剂盒的操作步骤提 取总ＲＮＡ。根据ＧｅｎＢａｎｋ的ＩＬ一１５的完整的ＣＤＳ， 设计上游引物５ 端加上ＮｄｅＩ酶切位点的Ｐ１：５ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＦＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＡＣ、 下游引物引物５ 端加上Ｘｈｏ Ｉ酶切位点Ｐ２：３ＥＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＧＴ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＩ＂，参照 ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒实验手册，以Ｐ２为特异下游引物、 以Ｐ１／Ｐ２经一步法合成出ＩＬ一１５ ｃＤＮＡ。ＰＣＲ条件为 ９４ｃｃ ４０ ｓ，５５ｏＣ ４０ｓ，７２ｃｃ １ ｍｉｎ，２８个循环。 １．２．３表达重组体的构建、转化及筛选上述ＰＣＲ 扩增产物通过琼脂糖电泳、回收。回收产物与载体 质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）经ＮｄｅＩ和Ｘｂａ Ｉ双酶切，３７ｏＣ ６ ｈ。回收ＩＬ一１５ｃＤＮＡ片段和载体片段的酶切产物， 按１０：１的摩尔比，用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶，１６￣（２连接过 夜，构建ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＩＬ一１５表达质粒。将连接产物 转化ＪＭ１０９，ＰＣＲ法筛选出阳性克隆，扩增提取质 粒，ＮｄｅＩ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切、测序（由上海生工生物工 程技术服务有限公司完成）鉴定。 １．２．４ ｐＥＴ２８ａ（＋）一ＩＬ一１５的诱导表达将ｐＥＴ２８ａ （＋）一ＩＬｌ５质粒１０ ｎｇ转化ＢＩ２１（ＤＥ３）宿主菌中， 在含３０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的平板上培养１４ ｈ，挑取单 个克隆接种于５０ ｍｌ的含３０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ 培养基中，３７ｃｃ，振荡培养到Ａ６００达０．８时加入 ＩｔｒＦＧ至终浓度１ ｍｍｏｌ／Ｌ，３７ｏＣ，诱导６ ｈ。 １．２．５ ｈｌＬ一１５的表达及鉴定取诱导培养液１ ｍｌ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｓ收集菌体，加５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ７．４，０．５ ｍｌ重悬沉淀，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心２０ ｍｉｎ，去上清，加２５ ｌ双蒸水混匀后，加等体 积的２×加样缓冲液，９９￣Ｃ变性１０ ｍｉｎ。菌体总蛋 白、胞质上清进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ鉴 定 维普资讯 http://www.cqvip.com
４９２ ２结果 （Ｌ）Ｅ３）ｆ 丰茼， 表达产物为带柏 ¨ｉ －Ｔａｇ标签的 融合蛋白．－ 通过金属螯乖¨ 析进・步纯化 淋巴 胞ｌ｝１分离 ３讨论 ２．１ ＲＴ．ＰＣＲ扩增ｈＩＬ－１５基因近冉一条带． ｊ １ 的ＲＮＡ．终ｌ“一｝】（＿Ｒ扩增ｆＵ泳分析．住约３６０ Ｉ）１）ｌ｝『＿『 ｌ１ 一１５坫一个健炎‘ 细胞冈 ． 天然免疫系统 ＿｝】发挥重要作用很多 ｌ【织丧达】Ｉ，－１ ５受伴．１１ 一】５ 先激活ＪＡＫｌ／３、进ｍ使 ［］ 图Ｉ ＲＴ－ＰＣＲ扩坦Ｉｌ －Ｉ５基因及重组体酶切结果 通过与其受体结 ＳＴＡＴ３／＇５／６磷酸化诱导下游摧陶；【 】一ｌ５ ｕｌ－以激活 一・桐荚的酪氡艘激酶、瞬导 １—２发达、激活Ｉ￣ａｓ／ Ｒａｇ＂ＭＡＩ Ｋ途 最终活化ｆｏ￣／ｊｕｎ ． 某 细胞 【１ 呵以澈活 Ｒ．．ＩＩ 一ｌ ５通过其受体澈活ｒ游基Ｊ 是 达，进一步渊 细胞的 州功能徊ｆ究丧Ｉ』ｌｊ】１．＿１５ 疾痫、结 Ｉ Ｈ１’兀．Ｒ扩增ＩＩ Ｉ５ ｌｑ：２术昧Ｉ Ｌ的 件：４ ｎ＾Ｍ…ｋ ＪｒＩＩＬＩ５ｌ ｘ＿Ｏ＋ＩＩＩ２ＩＨ砌 悼；３经毓ｌ＝ｉ：Ｊ的－驻 参与ｉ＂ｔ：多疾痫的发病．如自身免嫂技炎 竹病、多发 骨髓蝌、免疫排斥等 。 此深入研 ２．２ 重组质粒的鉴定 重组质粒经Ｎｄｅｌ雨『Ｘｈｏ Ｊ 陷 后，经琼 糖电泳分析｜， 到约３６０ ｂｌ， 大ｆ ５ ０００ ・彳］’州个条带，与预剖的ｈｉ［ 一ｌ５的基因片段 （３６】ｈｐ）和ｐＥ’１２８ａ（＋）质牲ＤＮＡ（５ ３６９ ｂｐ）大小 究ｌＩ＿一】５有利１：闸叫一 疾痫发病 ｌ制、诊断驶治 疗 我们采用Ｒｌｒ－Ｈ：Ｒ从人外周儿『【＝淋 细胞中扩增 …ｈＩ【 －ｌ５ 【乇＝ ・】 Ａ，通过发达载体转化大物ｆｆ佯ｆ 卡Ｈ一致Ｈ时测序绱累通过ｃｅｎＢａｎｋ比埘・』人ｌＩ— Ｉ ｌ５的，”ｌ｛ Ａ序列耗ｌｌ司．成功构建＿ｒ ＰＥ１２８ａ（＋）． ｈＩ】，Ｉ５表达毅体． 的鉴定ＤＥ３，１）Ｅ３表达的融台蚩ｆ１其尾端 有６ １、｝Ｉｌ氯酸． 此，可通过 属螫台层析法进・步浓缩和继化．为 ｌｌ一１５ 划暨抗体的制备挺供夫量的较高纯度的抗 原物质 蚌为进一步研究奠定堆础． 参考文献 ２．３ ｐＥＴ２８ａ（＋）－ｈＩＬ－ＩＳ的诱导表达及表达产物 ｌ’＝ｆ＝ｌ １２８ａ（十）一１１ 一Ｉ５丧达的融台蛋白分ｆ 理ｉＩｆ＝瓶为１６ １ ｋｌＪ．经ＳＤＳ—ＰＡ（ 鉴定住约１６ ｋｌｌ 附近处出现ｒ一条明矬的特异蛋白条带．见图２ ●篓 雾 １ —３ ４ ５ Ｗｅｓｌ ｍ—ｂｌｏｌ硅示为约Ｉ６ ｋｕ特异条带和删沦值卡Ｈ 符，见罔３ Ｊ２８ａ（＋）－ｈｌＬ一１５质粒转化剑Ｂｌ２【 萎啊 ｉ二－－ 委 篓 裟 ～～ 图 玎．・１５ Ｗｔ￣ｅｒｎ—ｂｌｏｔ分析结果 壳 总监Ｉ－Ｉ； 求睡 １冉总监 Ｉ；３ ｐ ８转化 导 总 维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２００６ Ｏｃｔ；４１（５） 。４９３・ 不同转移潜能的人前列腺癌细胞 原位转移模型的建立与比较 张明霞，张玉侠，邓松华 摘要 目的建立不同转移潜能的人前列腺癌细胞转移模 利用人前列腺癌细胞系ＰＣ３单克 前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的肿瘤， 在美国肿瘤致死的男性人群中，前列腺癌占第二位， 仅次于肺癌 。近年来，我国随着人口老龄化和饮 食结构的改变，前列腺癌的发病率和死亡率有逐年 增高的趋势 Ｊ。前列腺癌转移发生早是治疗失败 的主要原因，为深入了解前列腺癌细胞的恶性生物 型，并比较其结果。方法隆细胞株裸鼠皮下移植瘤，通过外科原位移植技术植入 ＢＡＬＢ／ｃ．ｎｕ／ｎｕ雄性裸小鼠，建立人前列腺癌高、低转移细胞 株转移模型；并观察比较两细胞株转移模型的原位成瘤率、 自发转移率、两细胞株形态学特征和转移抑制基因ＣＤ４４ｓ 的表达。结果人前列腺癌高转移细胞株裸鼠原位种植后 原位成瘤率１００％，主动脉旁淋巴结转移率为１００％，低转移 细胞株裸鼠原位种植后原位成瘤率１００％，主动脉旁淋巴结 转移率为４０％，两者主动脉旁淋巴结转移率差异有显著性 （Ｐ＜０．０５）。高、低转移细胞株形态学特征亦不同。ＣＩＭ４ｓ 蛋白在人前列腺癌高转移性单克隆细胞株ＰＣ３一Ｈ中的表达 强度低于低转移性单克隆细胞株ＰＣ３．Ｌ。结论人前列腺癌转移机制提供了有力工具。 主题词达 中图分类号Ｒ７３７．２５；Ｒ一３３２ 学行为，需要建立相应的模型和方法。本课题旨在 对转移性人前列腺癌细胞系ＰＣ３进行优化选择，以 建立更符合临床和实验研究需要的转移性人前列腺 癌细胞模型系统，为推动深入研究人前列腺癌转移 机制、寻找预测转移的新指标、筛选防治新策略奠定 工作基础。 １材料与方法 遗传背景相 似的人前列腺癌高、低转移细胞株原位移植转移模型为研究 前列腺肿瘤；肿瘤转移；小鼠，裸；细胞系；基因表 １．１材料和裸鼠ＰＣ３细胞系购于中国科学院上 海细胞生物研究所。所用试剂和仪器为：美国Ｇｉｂｃｏ 公司的Ｈａｍ Ｆ１２培养液，杭州四季青生物技术公司 文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２００６）０５—０４９３—０４ 的胎牛血清，重庆麦克光电仪器有限公司的ＸＤＳ．１ Ｂ 倒置相差显微镜，美国ＲＥＶＣＯ公司的ＲＮＷ３０００． ２００６—０８一Ｏ１接收 ＴＶＢＢ二氧化碳培养箱，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司的鼠抗人 ２３００３２ 基金项目：安徽省自然科学基金资助课题（编号：０５０４３０７０６） 作者单位：安徽医科大学病理生理学教研室，合肥作者简介：张明霞，女，３１岁，硕士研究生； ＣＤ４４ｓ单抗，武汉博士德的小鼠抗人Ｂ．ｔｕｂｕｌｉｎ单抗 及ＨＲＰ・羊抗鼠ＩｇＧ，中科院上海生物化学研究所的 低分子量蛋白ｍａｒｋｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ公司的Ｈｙｂｏｎｄ． ＥＣＬ纤维素膜，Ｐｉｅｒｃｅ公司的ＥＣＬ检测系统， 邓松华，男，５２岁，教授，硕士生导师，责任作者，Ｅ—ｍａｉｌ ＤＥＳ０Ｈ＠１２６．Ｃ０Ｍ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５ ｃＤＮＡ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ Ｌｕｏ Ｘｉｎ，Ｘｕ Ｃｏｎｇｚｈｅｎ，Ｆａｎｇ Ｍｉｎ， ａｌ （Ｄｅｐｔ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆ ｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３２） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ．１５（ｈＩＬ．１５）ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ．ｈＩＬ．１５ ｃＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＲＴ．ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ（＋）・ｈｉＬｌ５ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｕｃｔｒｅｄ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ ＩＬ．１５ ｃＤＮＡ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２８ａ（＋）ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗａｓ ｔｒａｎｓｏｒｆｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｂ １（ＤＥ３）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈＩＬ．１５ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉ Ｇ ａｔ ３７℃ｆ０ｒ ６ｈ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ＳＤＳ・ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｈＩＬ．１５ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｓＨａｃｅｓｓｆｕｌｌｖ． ＳＤＳ・ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ．１５ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １６１ ｋｕ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｈＩＬ．１５ Ｗａｓ ．ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ。ｗｈｉｃｈ ｌａｙｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． ＭｅＳＨ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ・１５／ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
