重组人肿瘤坏死因子ａ粗提取的集成化工艺 朱爱华’王莉’王云山２苏志国２马润宇’（１．北京化工大学化学工程学院，北京１０００２９； ２．中国科学院过程工程研究所，北京１０００８０）摘要通过研究重组人钟瘤坏死因子ａ （ｒｈＴＮＦ－ａ）的粗提取工艺中各操作条件对目标蛋白纯化的影响，发展了一条纯化ｒｈＴＮＦ－ ａ的集成化工艺。该工艺组合细她破碎，热吏性与硫艘按分极沉淀，有效节省离心步赚，缩姐工艺流程，所得粗提物中目标蛋白占总蛋白含蚤的５７％，目标蛋白回收率为９０．３％，活性回收率为８５．８％，各项相标均比未集成的工艺有较大程度上的提高。关扭词肿摘坏死因子珠磨玻碎集成蛋白质纯化 肿瘤坏死因子ａ （Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｏｒｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａ， ＴＮＦ－ａ）是一种由内毒素激活的巨噬细胞产生的仅对肿瘤细胞有杀伤力而对正常细胞无细胞毒作用的非种属特异性活性因子，同时也是机体炎症与免疫的重要调节因子。它是一种含有！５７个氨基酸的非糖基化蛋白，相对分子量大约为１７３５０，其热稳定性好，天然活性形式是三聚体Ｕｌ。早在１９８４年，美国生物学家就成功地在大肠杆菌中克隆表达了人肿瘤坏死因子。由于重组表达的ＴＮＦ大都分泌在胞内，因此分离ＴＮＦ必须先破碎细胞ｏ Ｌｕｋｓ，等人利用超声破碎ｆ２１， ｐａｑｕｅｓｔ等人利用酶解破壁ｔ３１超声破碎产生的自由基会使某些蛋白质变性失活，而溶菌酶价格昂贵。相比之下，珠磨法破碎操作简单，成本低廉，适应大规模工业生产的需要。细胞破碎液在层析操作之前加人一些简单的除杂工序，有利于提高层析的分离精度，减少介质用量。王光虎等人曾利用ｒｈＴＮＦ一ａ的耐热特性４２℃热处理３０ ｍｉｎ获得活性回收率８８．５％，纯化１．１９倍的ＴＮＦＩ＇１，徐皓等人曾利用硫酸钱分级沉淀分离纯化ＴＮＦＩ３Ｉ，但前者纯化倍数偏低，处理时间偏长。联合这两步操作提取基因工程蛋白质的研究近年来屡有报道，但迄今为止还没有人将这两者结合在一起纯化ｒｈＴＮＦ。本文所作的主要工作为６０℃热处理ｒｈＴＮＦ－ａｌ０ ｍｉｎ，结合硫酸按分级沉淀，从两者的先后顺序以及减少离心次数出发，设计了组合粗提取工艺。１材料与方法］．１菌种ｐＥＴ２１ ａ一ＴＮＦ质粒为本室构建，表达的ＴＮＦ不形成包涵体。表达宿主菌株为Ｅ． ｃｏｌｉ Ｂ１２１．１．２发酵 含ｐＥＴ２１ａ一ＴＮＦ的大肠杆菌在含氛节青排素的ＬＢ培养基中培养５小时后加人Ｈ，ＴＧ（控制终浓度在１ ｍｍｏｌ ＂ Ｌ－＇）诱导３小时。发酵条件：温度３７ ｀Ｃ，搅拌转速３００ ｒｐｍ，通气量０．５一０．６ｖｖｍ， ｐＨ控制在７．５。发醉雄为ＢＩＯＦＬＯ Ｉ，美国ＮＢＳ公司产品。．１３ ＴＮＦ活性测定参照Ａｇ ｇａｒｗａｌ的方法［６１． Ｌ９２９细胞由协和医科大学药物研究所提供。１．４蛋白质浓度浏定参照Ｂｒ ａｄｆｏｒｄ法ｂ１，以牛血清白蛋白为基准。１．５ ＴＮＦ纯度浏定参照王光虎的方法，用ＳＤＳ － ＰＡＧＥ测定［［ｓ１，由灰度扫描分析软件计算出目标蛋白占总蛋白的质量百分数。ＳＤＳ一ＰＡＧＥ操作条件：１５％分离胶，４．５％浓缩胶。考马斯亮蓝Ｒ２５０染色。标准分子量蛋白为中科院上海生化研究所监制。１．６细胞破碎离心收集菌体，充分洗涤后按液质比４： １悬浮于２０ｍＭ Ｉ ｐＨ ７．５的磷酸盐缓冲液中，间歇４８５ 式珠磨破碎３ ｍｉｎ。珠磨机为ＫＤＬ型Ｄｙｎｏ一ｍｉｌｌ ，瑞士ＷＡＢ产品。破碎条件参照Ｗａｎｇ Ｇｕａｎｇｈｕ等人的方法‘’｝，玻璃珠直径为０．２５一。．５０ ｍｍ，装珠量为破碎室总体积的８５％，搅拌转速１５００ ｒｐｍｏ破碎液于４＇Ｃ、１５０００ ｒｐｍ离心１５ ｍｉｎ除细胞碎片。１．，热变性待样品在恒温水浴振荡器中升温到６ ０℃时开始，计时１０ ｍｉｎ。变性液于４９Ｃ ， １５０００ ｒｐｍ离心１５ ｍｉｎ留上清。１．８硫酸按分级沉淀参考徐皓的方法Ｉ ｓｌ。室温下缓慢加人４０％饱和度的硫酸钱，边加边搅拌，待全部加完后置于４℃冰箱，ｌｈｒ后离心，取上清加入硫酸按至６５％饱和度后再置于４℃冰箱，ｌ ｈｒ后离心，弃去上清加适量磷酸盐缓冲液溶解沉淀，最后离心收集上清。２结果与讨论２．１初步联合热变性与硫酸按沉淀的粗提取工艺 细胞破碎，离心，取上清热变性，离心留上清４０％一６５％硫酸按分级沉淀，最后离心收集上清即ｒｈＴＮＦ粗提物。表１列出了各阶段的纯化结果，纯化倍数定义为纯化前后比活的比值。Ｔａｂｌ ｅ． Ｉ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｍＷａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ一ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ （Ｎ氏）ｓｏ４总活性比活 袅１初步翻成的纯化结果 ／ （１护Ｕ）破碎清液 热变性清掖 ４０％一６５％硫酸按沉淀（１０４ Ｕ． Ｍｇ－’总蛋白） 总活性回收率１％ 纯化倍数７．７７ １．７＿＿＿＿＿＿７．４３ ２．６ ９５．６ １．５３５．６０ ５．５ ７２．１ ３．２４二由于未加放线菌素Ｄ，所侧的活性较文献偏低 结果表明热变性以后，ｒ ｈＴＮＦ一。的总活性回收率为％．６％，比活提高到１．５３倍，高于王光虎等人的１．１９倍，而处理时间仅为原来的三分之一。由此可见，印℃热处理１０ ｍｉｎ除杂蛋白更为有效。从实验结果还可以计算出硫酸按分级沉淀的纯化倍数为５．５１２．６二２．１２倍，活性回收率为５．６０１７．４３二７５．４％，总活性回收率为７２．１％，可见联合运用这两种初分离手段是很有效的。２．２几种粗提取组合工艺的比较 由于上述粗提取工艺各个处理阶段都经过离心，而离心次数越多，回收率就越低，因而需要进一步优化。考虑到后续柱层析的需要，总是把６５％硫酸按沉淀放到最后一步，按照破碎后是否离心，热变性后是否离心，以及两者之间的先后顺序设计八组实验，如图ｔｏ ，细胭破碎二卜热变性二卜４０％硫酸按沉淀召卜６５％硫酸按沉淀：细胞破碎召卜热变性一４ ０％硫酸按沉淀召卜。％硫政按沉淀：细胭破碎召卜４ ０％位酸性沉淀召卜热变性召卜。％硫酸按沉淀；细胞破碎召卜，％硫故性沉淀一热变性１ －－１－Ｌ０－６５％硫触俊沉淀５细．破碎一热变性召粉４ ０％硫酸铁沉淀召卜６５％硫酸馁沉淀６细胭破碎一热变性一。％硫映筱沉淀召卜。％硫酸俊沉淀 ：细胭破碎一。硫故按沉淀召卜热变性二卜６ ５％硫映馁沉淀：细胞破碎一４ ０、班酸铁沉淀一热变讨卜６５％硫破钱沉淀Ｆｉ ｇ． Ｉ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｎｅｐａｒｖｉｄｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ圈１姐合粗级取实脸设计圈 收集上述工艺的最终上清进行ＳＤＳ一ＰＡＧＥ电泳，结果如图２， Ｍ为标准分子量蛋白４８６可见纯化后在１７００（〕分子量处有明显的目标蛋白条带。圈２工艺．终产品的ＳＤＳ一ＰＡＧＥ电泳圈ＦＹｇ．２ ＳＤＳ一ＰＡＧＥ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ｅｉｇｈｔ目．妇ｏｆ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ 用Ａｇｇａｒｗａｌ的方法测定破碎清液单位体积活性为１．８５ ｘ １０５ Ｕ／ ｍｌ，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定出破碎清液体总蛋白浓度为１０．８９ｍｇ／ｍｌ，用ＳＤＳ一ＰＡＧＥ法测定破碎清液中ＴＮＦ占总蛋白百分含量为１５％。以破碎清液为基准，测定结果列表如下，其中纯化倍数定义为ＴＮＦ纯度之比。斑２不同组合粗提取方式的纯化结． Ｔａｂｌ ｅ．２ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｉｄｎｄｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＰｒｏｃｅｓｓｅｓＴＮＦ纯度 ＴＮＦ含量 ＴＮＦ 〔艺总蛋白 ＴＮＦ 总活性 回收率／ ９０回收率１％／ （ｍｇＴＮＦ＂１００ｍｇ一’总／（ｍｇＴＮＦ＂ｍｌ一１上回收率１％ｘ自）清） 纯化倍数２３．１４６．ｇ５．３２３．２６ ６８．１２３．３８４．１５４．１５．９４３．６１劝‘］５７．４８５．０２２．２２．２（１１．４８ ８０．８５８．２９１．６２３．６２．４１１．５７ ８６．１２３．４７７．０４９．４５．５６３．２９ ７２．８２３．８９０．３５７．０６．２４３．８０ ８５．８５７．０８８．５２４．５２．３４１．６３ ８３．０５８．４９１．８２５．２２．５３１．６８ ８６．２ 从总活性回收率与ＴＮＦ回收率的对比可以看出，各条处理工艺都基本保持了ＴＮＦ的活性．从电泳图谱和表２中的结果可以很明显地看出工艺６是最佳路线，其目标蛋白纯度最高，而且目标蛋白回收率和活性回收率分别达到了９０．３％， ８５．８％ａ２．２．１热变性与４０％硫酸钱沉淀的先后顺序对目标蛋白纯化的影响从电泳图和表２中的数据可以明显看出热变性在前的工艺终产物中目标蛋白占总蛋白的百分 含量大大高于４０％硫酸按沉淀在前的工艺，可见４０％硫酸馁沉淀在前极其不利于目标蛋白的纯化。从４０％硫酸铁沉淀在前的总蛋白回收率大大高于热变性在前的回收率这个现象笔者推测可能原因在于有硫酸馁存在的条件下蛋白不容易变性，从电泳图也可以看出４０％硫酸钱沉淀在前的杂蛋白条带相对目标蛋白很浓，说明其所占比重很大。从最终ＴＮＦ在溶液中的浓度来看，热变性在前的工艺也优于４０％硫酸按沉淀在前。后续的 讨论都集中在热变性在前的工艺中。２．２．２离心对目标蛋白纯化的影响２．２．２．１破碎后离心对目标蛋白纯化的影响比较工艺１与５的最终结果可以看出细胞破碎后离心对于目标蛋白的纯化影响不大，破碎液 ４９７ 未经离心直接进行后续处理能够稍稍提高ＴＮＦ的回收率。比较２与６也可以得出相同的结论。２．２．２．２热变性后离心对目标蛋白纯化的影响比较工艺１与２的最终结果可以看出未经离心直接４０％硫酸按沉淀能有效提高目标蛋白的 回收率和纯度。从电泳图上也可以看出热变性后离心的工艺１所得到的最终上清比未经离心的杂蛋白条带多，而且所占比重大。综合以上分析可知最佳工艺为细胞破碎后直接热变性接着直接４０％一６ ５％硫酸按分级沉淀，该工艺与未集成的工艺１相比极大程度上节省离心次数，目标蛋白在溶液中的浓度提高１７．３％，纯度提高２１．８％，回收率提高２５．４％，总活性回收率提高２６％．２．３讨论 本文均采用最终结果间接讨论各条工艺的差异原因有如下几点：首先，分离过程中未经离心的中间样品如果取样分析，必须要经过离心，这样实际上与经过离心是同样的处理工艺，因此离心与未经离心的样品不能立刻比较；其次，若添加同样的后续处理工艺，如热变性来间接说明前一步的影响也不充分，因为离心与未经离心的差别造成了后续处理对象的相系统不一致，使得热变性本身能够产生的效果不一致，即离心与未经离心本身也许没有什么差别，但是相环境的不一致可能会导致热变性结果的差异，把这个差异归结为离心对于目标蛋白纯化的影响是不合适的。所以本文直接从工程角度出发，不讨论中间操作的具体影响，直接按照最终的结果来判断中间差异步熟的利弊。３结论 （１）硫酸按沉淀能有效去除大量杂蛋白，浓缩目标蛋白并保待其稳定性和生物活性。（ ２）联合热变性与硫酸按分级沉淀的处理工艺能有效提高目标蛋白纯度。（ ３）热变性在前时最终产品的纯度大大高于４０％硫酸按沉淀在前的纯度。（ ４）最优工艺为细胞破碎后直接热变性接着直接４０％一６５％硫酸铁分级沉淀，该工艺与未集成的工艺相比，不仅节省离心次数，而且目标蛋白损失少，纯度高。今考文献 ［１１ Ｆｅｎｇ Ｘ Ｌ， Ｇｏ Ｚ Ｙ， Ｊｉｎ Ｙ Ｔ， ｅｔ ａ］． Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｉｍｐｏｒｖｅｓ ｔｈｅ ｐｕｒｉｉｆｃａｉｔｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ加￣ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｏｒｓｉｓｆ ａｃｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｉｏｎ ｅｘｃｌｕｍｇｅ ｃｈｏｒｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １９９８， １２ （４） ： ２８９一２９３［２） Ｌｕｔｓａ Ｊ， Ｍｅｎａｃｅ Ｖ， Ｍｉｌｉｃｉｃ Ｓ， ｅｔ ａ］． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ场ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｃｎａｔｏｇｒｅ－ｐ ｈｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １９９４，“卜１６１一１６８［３） Ｐａｑｕｅｓｔ Ａ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｏｒｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｍｍ－ｅ ｔｏｇｒａｐｈｙ， １９９４，“，二１２５一１３０［４）王光虎，冯小黎，张晓靖，等．肿瘤坏死因子的分离纯化．生物工程学报，１９９９， １５ （２）：”。一２７３［５）徐皓，高长寿，刘惠，等．人肿瘤坏死因子及其突变休的基因工程下游工艺研究．生物工程学报，１９９８， １４（２）： １６４一１６９［６） Ａｇｇｅｎｒａｌ Ｂ Ｂ， Ｋｏｈｎ Ｗ Ｊ， Ｈａｓｓ Ｐ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｕｔｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９８５， ２６０： ２３４５一２３５４［７） Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ Ｍ． Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｉｔｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｉｚｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ一ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ， １９７６，”：２４８一２５４［８］ Ｗａｎｇ Ｇ Ｈ， Ｆｅｎｇ Ｘ Ｌ， Ｓｏ Ｚ Ｇ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｃｃｌｌ Ｄｉｓｕｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗ。一Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｍｃｉｔｏｎ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｍ－ｃｅ ｌｕｌａｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｍｔｅｉｎｓ． Ｃｈｉｎｅｓｅ ｌｏｕｍａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １９９９，，（２） ： １３９一１４４４８８Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＮｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒａｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＺＨＵ Ａｉ－ｈｕａ＇，ＷＡＮＧ‘，，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｓｈａｈ＇，ＳＵ Ｚｈｉ－ｇｕｍ＇，ＭＡ Ｒｕｎ一，，（Ｉ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２９；２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８０， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ （ｒｈＴＮＦ一ａ） ｗａｓ ｒｅｌｅａｓｅｄｆｏｒｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｂｙ ｂｅａｄ ｍｉｌｌＦｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｏｎｅ场ｅｉｇｈｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ，ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｈＴＮＦ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔ ｉｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒｈＴＮＦ一．ｔｏ ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ５７％ａ ａｎｄｔｈｅ ｅｒｃｏｖｅｒｙｈｒａｅａｔｅｔｏｆ ｒｂＴＮＦ ａｎｄ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ９０．３％，８５．８％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｂｅａｄ ｍｉｌｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４８９
