珍珠层粉氨基酸指纹图谱的构建及氨基酸含量测定的研究

冯 丹I,柯尊洪2,林瑞超邹迪新3**(1.北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室 北京100102；2.成都康弘制药有限公司成都610036； 3.中国中医科学院中药研究所北京100700)摘要：目的建立中药珍珠层粉HPLC氨基酸指纹图谱，进行指纹图谱的模式识别研究，并测定珍珠层粉

的氨基酸含量，为珍珠层粉质量评价提供依据；方法 采用Venusil-AA氨基酸分析柱(4.6 mm X 250 mm,5 pjn,

柱号：AA952505-0)，柱温:28七，进样量。10 g,波长：254 nm,流速:0.9 mL• min''，以pH为6.5的醋酸钠水溶液

为流动相A,以80%乙睛水溶液为流动相B。运用SAS和SPSS统计软件进行聚类分析和主成分分析，对珍珠层

粉指纹图谱进行模式识别研究。结果建立了珍珠层粉氨基酸指纹图谱，以及氨基酸指纹图谱的共有模式，检 测出23个共有峰，并指认出其中15个共有峰相似度分析的结果与聚类分析和主成分分析保持一致，不同产地

的珍珠层粉氨基酸成分差异不大，但不同基源的珍珠层粉氨基酸成分差异明显。本研究测定17个批次珍珠层 粉中17种氨基酸(Asp天门冬氨酸、Glu谷氨酸、Ser丝氨酸、Gly甘氨酸、His组氨酸、Arg精氨酸、Thr苏氨酸、Ala

丙氨酸、Pro脯氨酸、Tyr酪氨酸、Val缢氨酸、Met蛋氨酸、Cys胱氨酸、lie异亮氨酸、Leu亮氨酸、Phe苯丙氨酸、Lys

赖氨酸)的含量。结论本研究建立的珍珠层粉氨基酸指纹图谱分析方法专属性强，及氨基酸含量测定方法简 便易行、准确可靠，可对珍珠层粉的质量评价提供依据。关键词:珍珠层粉氨基酸指纹图谱氨基酸含量测定聚类分析主成分分析doi： 10.11842/wst.2019.07.011 中图分类号:R284.1 文献标识码：A珍珠层粉为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii

珠层粉的确是同质同效的珍珠粉代用品，无论内服外 (Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动

用,均无任何毒性和副作用,即珍珠层粉供药用具有可 物马氏珍珠贝Pteria martensii (Dunker)的贝壳珍珠层 行性斥 珍珠层粉由95%的碳酸钙和5%的有机质，以

加工而成的粉末具有镇静安神、解毒生肌、美容养

及一些微量元素等组成％其中，有机质主要为蛋白 颜、明目消翳、治疗溃疡、祛除肝火等功效叫收载于

质，水解后得到17种氨基酸，而氨基酸是珍珠和珍珠 《卫生部药品标准•中药成方制剂(第六册)》、四川省中 层粉发挥特定功效的重要物质基础冋,因此建立珍珠 药材标准(1987年版)以及福建省中药材标准(2006年

层粉氨基酸的质量评价标准尤为重要。现有的测定氨

版)等标准中。贝壳珍珠层与珍珠均为贝体内的外套 基酸含量文献记载，多采用分光光度计法化全自动氨 膜上皮细胞分泌出的珍珠质积累而成,经证实贝壳珍

基酸分析仪法5、高效液相柱前衍生测定法\"切及高

效液相柱后衍生测定法的。然而，由于分光光度法灵

收稿 EJ 期：2019-06-10敏度较低;全自动氨基酸分析仪价格昂贵，不能广泛地修回日期：2019-07-13* 国家中医药管理局国家中药标准化项目(ZYBZH-C-SC-54)：松龄血脉康胶囊标准化建设，负责人：刘荣高。* * 通讯作者：林瑞超，博士，教授，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药品质评价研究；邹迪新，博士，讲师，主要研究方向：中药药效物质基础与作用机制研究。〔World. Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕13532019第二十一卷第七期★Vol. 21 No.7表1 17批珍珠层粉信息批次SI基原25 mL氨基酸消解管，氨基酸分析柱Venusil-AA (4.6 mm x 250 mm, 5 pm,艾杰尔科技)，鼓风干燥箱

(天津市泰斯特仪器有限公司)，1000)xL移液

产地及收集年份三角帆蚌三角帆蚌三角帆蚌浙江诸暨2017年浙江诸暨江薄2017年浙江诸暨阮市2017年S2S3(eppendorf) ,200 |jlL 移液(eppendorf) ,20 jiL 移液

(eppendorf)，十万分之一分析天平(Mettler Toledo公

司)，氮吹仪,DK-98-l型电热恒温水浴锅(天津市泰 斯特仪器有限公司)，真空抽滤系统(IKA),抽滤瓶，烧

S4三角帆蚌河南信阳罗山2018年广东澳珍药业170802批次2017年广东澳珍药业170902批次2017年广东湛江2017年湖南常德2018年浙江诸暨2018年S5S6S7S8S9三角机蚌三角帆蚌马氏珍珠贝杯,玻璃棒，容量瓶,蒸发皿,0.22 ixm微孔滤膜，一次性

三角帆蚌三角帆蚌三角帆蚌2 mL注射器(江苏宇阳医疗器械有限公司)，离心管。1.2试药S10安徽黄山2018年浙江诸暨2018年浙江诸暨2018年北海国发海洋生物产业股份有限公司2018年1.2.1试剂氨基酸分析方法包:17种氨基酸混合标准品(天

SilS12三角帆蚌三角帆蚌马氏珍珠贝马氏珍珠贝马氏珍珠贝马氏珍珠贝门冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、丝氨酸Ser、甘氨酸Gly、组 氨酸His、精氨酸Arg、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸

S13S14湛江海洋大学2018年湛江海洋大学2018年Pro、酪氨酸Tyr、绷氨酸Vai、蛋氨酸Met、异亮氨酸lie、

亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、赖氨酸Lyb各为2.5 |±mol•

S15S16湛江海洋大学2018年浙江诸暨阮市2017年S17三角帆蚌mL1,胱氨酸Cys为1.25 |xmol• mL'1)、正亮氨酸标准

品、三乙胺、异硫氤酸苯酯(PITC)等(均由艾杰尔科技 提供);纯净水，色谱乙月青(赛默飞世尔科技)，无水醋酸 钠(北京化工厂)、乙酸(色谱级，赛默飞世尔科技)、浓

普及；高效液相柱后衍生测定法虽然准确度较高,但是 消耗时间过长，灵敏度低,故选择最为简便、高效、准确 的高效液相柱前衍生化方法。柱前衍生化法也根据衍

盐酸(37.5%,北京化工厂)、正已烷(天津市津科精细 化工研究所)。生化试剂的不同分为:邻苯二甲醛(OPA)、氯甲酸茹甲

酯(FMOC-C1),异硫氧酸苯酯(PITC)、丹酰氯(Dansyl- 1.2.2溶液配制冋C1)、二甲胺偶氮苯磺酰氯(Dabsyl-Cl)和6-氨基座琳-

N-轻基琥珀酰亚胺基氨基甲酸醋(AQC)等耳切。根据

相关的氨基酸含量测定文献叫呦,艾杰尔氨基酸分析方

(1) 三乙胺乙月青溶液：取三乙胺1.4 mL,加乙月青 8.6 mL,混匀。(2) 异硫氧酸苯酯乙月青溶液：取异硫氤酸苯酯

25 jxL,加乙月青2 mL混匀。法包具有准确、高效、分离效果好等优点。本次实验经

过对大量文献进行筛查,最终确定使用高效液相柱前

(3) 流动相A：80%乙月青；水溶液流动相B：称取15.2 g无水乙酸钠，加水1850 mL,溶解后用乙酸调pH

至6.5,然后加乙月青140 mL,混匀,用0.45 |±m滤膜过滤。衍生化法，将异硫氤酸苯酯(PITC)和三乙胺作为衍生

化试剂，并采用艾杰尔氨基酸分析方法包。中药指纹 图谱是一种较为成熟的质量评价手段,该技术已被广

(4) 正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10 mg,

加0.1 mol-L-'S酸溶液10 mL使溶解，混匀。泛用于中药的质量控制领域，可较为全面地反映中药 材的特征田糾,本次研究将指纹图谱技术首次运用到中

1.2.3珍珠层粉药材共收集了 17批珍珠层粉，来自于浙江、河南、广

药珍珠层粉上，建立珍珠层粉氨基酸指纹图谱,并进行 氨基酸含量的测定，旨在为珍珠层粉质量标准的建设

东、广西、湖南、安徽等六个省份，17批珍珠层粉的样 品信息(表1),其中S5-6,S13-16号样品通过公司途径

提供依据。1仪器与试药收集,其余样品均收集于当地珍珠养殖场,收集时均为

新鲜或干燥蚌体,依照文献中记载的珍珠层粉制备方

1.1仪器Waters2695高效液相色谱仪(PDA检测器),KQ-

法，经本实验室后期加工得到舛呦。三角帆蚌基源的 珍珠层粉均为淡水珍珠层粉,而马氏珍珠贝基源的珍 珠层粉均为海水珍珠层粉。500DE超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，

1354(World. Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica ]世界科学技术一中医药现代化★中药研究2方法与结果表2梯度洗脱程序2.1色谱条件与系统适用性试验时间/min流动相A/%流动相B/%

00100米用Venusil- AA氨基酸分析柱（4.6 mm X

20100250 mm,5 pcm）,以80%乙月青水溶液为流动相A,以乙

20298酸钠-乙月青-水溶液作为流动相B（pH为6.5）,柱温：

24208028七,进样量：10 |1L,检测波长:254 nm，流速:0.9 mL•

504555min\样品温度：5七,梯度洗脱程序（表2）。理论塔板

551000数按正亮氨酸峰计算应不低于2x 105,所有组分均在

45 min内出峰，17种氨基酸混合标准品,珍珠层粉氨基

酸色谱图（图1）。2.2粗蛋白的制备由于珍珠层粉中含有较多的钙盐,如果直接进行

水解，将与盐酸发生反应，生成大量的二氧化碳气体， 致使水解无法进行,故需要先制取粗蛋白。准确称取珍珠粉约10.0 g于1000 mL烧杯中，加水

10mL,搅拌调成糊状,缓慢分次加入6moL.L-'的稀盐

酸酸化4次，每次10 mL（酸化过程中产生的泡沫不得 有溢出等流失现象），在酸化的过程中,需要充分搅拌，

让稀盐酸和钙盐充分反应，自然放置,待泡基本消退 后,取合适大小的滤纸进行抽滤，并以水洗涤使其充分

B转移,抽滤近干时,续加6 moL• L\"的盐酸适量,浸没固 体物，检查有无气泡产生，轻轻震摇10 min使反应充

分，再抽滤,并重复上述浸泡操作，直至无气泡产生,最 后以水洗涤至洗液呈中性，得橙黄色或桔黄色粗蛋白

质。进行干燥和称重,计算粗蛋白产率的。2.3供试品衍生溶液的制备精密称取含量测定项下粗蛋白质10 mg,置于

. JJ.25 mL耐高温氨基酸消解管中，准确加入6moL・L「'的

盐酸5mL,加盖密封，置于110七下，水解24h,取出，放

o10

20

30

4050

60冷，开瓶，将水解液过滤并转移至蒸发皿中,水浴蒸干， 图1氨基酸对照品色图谱(A)、珍珠层粉氨基酸色图谱(B)

残渣以0.1 mol-L-'稀HC1溶解，移入5mL容量瓶中，定

注：1: Asp; 2: Glu; 3: Ser; 4: Gly; 5: His; 6: Arg; 7: Thr; 8: Ala; 9: Pro; 容，摇匀，微孔滤膜精滤（0.22）xm）,取续滤液200 piL 10: Tyr; 11: Vai; 12: Met; 13: Cys; 14: lie; 15: Leu; 16: Nle; 17: Phe; 18: Lys至2 mL小瓶中，依次准确加入14%的三乙胺乙月青溶 液、异硫氤酸苯酯乙月青溶液各100 “L,并准确加入正

2.5空白衍生溶液的制备亮氨酸内标溶液20 “L加盖，混匀，置于室温下衍生

按2.3所述，取纯净水200 jjlL至2 mL小瓶中，自 90 min,加正已烷400 fxL,振摇，静置约10 min,取下层

“依次准确加入14%的三乙胺乙月青溶液”起，至“高效

溶液，用0.22 |xm的微孔滤膜过滤，取续滤液200 jjlL, 液相小瓶中待用”即得空白溶液（空白衍生溶液中含有

加入800 pL水稀释，摇匀，于高效液相小瓶中待用何。

正亮氨酸）。2.4氨基酸混合标准品衍生溶液的制备2.6线性关系考察按2.3所述，取混合氨基酸标准溶液200 rL至

取氨基酸混合标准品溶液（除胱氨酸Cys为1.25

2 mL小瓶中，自“依次准确加入14%的三乙胺乙月青溶

p.mol- mL'1外,其余氨基酸浓度均为2.5 pmol • mL\"）,分

液”起,至“高效液相小瓶中待用”即得空白溶液。别将其稀释至浓度为 1.25、0.625、0.25、0.125、0.0625、〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 13552019第二十一卷第七期★Vol. 21 No.7表3线性关系实验结果氨基酸表5重复性试验（n = 6）线性范围

回归方程氨基酸天门冬氨酸AspR20.99RSD/%0.86/(ixmobmL')1.25-0.031251.25-0.031251.25-0.03125天门冬氨酸Asp7 = 0.8609%+ 0.0139y = 0.879% + 0.0042谷氨酸Glu0.850.28谷氨酸Glu丝氨酸Ser0.99930.9996丝氨酸Sery = 0.9656%+ 0.0019y = 0.9965% + 0.0033甘氨酸Gly组氨酸His精氨酸Arg苏氨酸Thr丙氨酸Ala0.34甘氨酸Gly0.99970.99941.25-0.031251.25-0.031251.25-0.031251.25-0.031254.370.260.49组氨酸His精氨酸Argy= 1.0062%-0.008y= 1.0099%-0.0061y = 0.9272% - 0.000.99950.99980.9996苏氨酸Thr丙氨酸Ala0.391.52y= 1.0147%-0.0076y= 1.074%-0.0016y= 1.1705%+ 0.00481.25-0.031251.25-0.031251.25-0.031251.25-0.031251.25-0.03125脯氨酸Pro酪氨酸Tyr脯氨酸Pro酪氨酸Tyr缢氨酸Vai0.99930.99940.210.440.361.21绷氨酸Vaiy= 1.1554%+ 0.0072y= 1.1114%+ 0.01450.99930.99980.9999蛋氨酸Met胱氨酸Cys异亮氨酸lie亮氨酸Leu蛋氨酸Met异亮氨酸lie亮氨酸Leuy= 1.1388%+ 0.0383y= 1」186%+ 0.0184y= 1.2549% + 0.007y = 2」lll% + 0.00191.25-0.031251.25-0.031251.25-0.031251.25-0.031251.300.310.340.970.99940.9938苯丙氨酸Phe赖氨酸Lyb苯丙氨酸Phe0.9998赖氨酸Lyb表4精密度实验（n = 6）氨基酸天门冬氨酸Asp3,由表3可知，除了胱氨酸Cys外,其余的16种氨基酸

RSD/%线性方程的疋均〉0.99o0.782.7精密度试验取17种氨基酸混合对照品溶液，按2.1项下色谱

谷氨酸Glu0.670.18丝氨酸Ser甘氨酸Gly0.670.260.680.87条件连续进样6次，记录峰面积，17种氨基酸中除了胱

组氨酸His精氨酸Arg苏氨酸Thr氨酸Cys外，16种氨基酸的峰面积RSD值均＜ 3%（表

4）,结果表明仪器精密度良好。2.8重复性试验取编号为14的广东湛江产马氏珍珠贝珍珠层粉，

丙氨酸Ala脯氨酸Pro0.0.73精密称定，按2.2和2.3项下的方法平行制6份供试品 溶液，按2.1项下色谱条件进行HPLC分析，结果17种

酪氨酸Tyr绮氨酸Vai0.260.190.2817.84氨基酸中除组氨酸His外，峰面积的RSD值均＜ 3%

蛋氨酸Met（表5）,表明方法的重复性较好。胱氨酸Cys异亮氨酸lie2.9稳定性试验取编号为14的广东湛江产马氏珍珠贝珍珠层粉，

0.260.200.33亮氨酸Leu苯丙氨酸Phe精密称定，按2.2和2.3项下的方法制备供试品溶液，分 别再溶液制备后0 h,4 h,8 h, 12 h,16 h,20h按2.1项 下色谱条件进行HPLC分析，结果17种氨基酸中除组

赖氨酸Lyb0.460.03125 iJimol-mV1的6个不同浓度的氨基酸标准溶

液，按照2.4项下制备方法制取不同浓度的氨基酸混合 标准品衍生溶液，按照2.1项下的色谱条件进行测定，

氨酸His外,峰面积的RSD值均＜ 3%,如表6所示，结 果表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。2.10回收率试验将混合标准品溶液稀释至8倍,使各氨基酸（除胱

以混合标准品中各氨基酸的浓度为横坐标，以各氨基

酸峰面积与正亮氨酸内标峰面积的比值为纵坐标建立

氨酸Cys为0.15625 ixmol-mL1外），各氨基酸的浓度均

线性回归方程，回归方程、相关系数及线性范围见表1356为0.3125 “mol • mL'1,将稀释8倍的氨基酸混合标准品〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica ]世界科学技术一中医药现代化★中药研究表6稳定性试验（» = 6）氨基酸RSD/%氨基酸RSD/%天门冬氨酸Asp谷氨酸Glu丝氨酸Ser1.400.88酪氨酸Tyr缢氨酸Vai0.520.220.600.148.690.370.75蛋氨酸Met胱氨酸Cys异亮氨酸lie亮氨酸Leu苯丙氨酸Phe0.401.01甘氨酸Gly组氨酸His精氨酸Arg0.720.13苏氨酸Thr丙氨酸Ala脯氨酸Pro0.911.050」00.75赖氨酸Lyb表7回收率实验（n = 6）氨基酸天门冬氨酸Asp1（回收率）98.45%2（回收率）9&61%100.65%101.11%101.53%3（回收率）99.08%4（回收率）99.62%5（回收率）6（回收率）100.94%101.57%RSD100.68%101.48%1.06%0.37%谷氨酸Glu丝氨酸Ser100.91%100.16%101.15%100.92%101.86%100.83%101.20%101.23%102.78%100.10%101.26%100.68%101.59%101.%101.57%102.03%101.01%0.52%0.72%0.40%甘氨酸Gly组氨酸His精氨酸Arg100.07%101.36%101.19%100.57%102.82%100.43%100.47%100.72%103.22%101.78%101.45%104.54%103.13%101.50%99.53%98.63%102.38%10134%0.92%0.79%苏氨酸Thr丙氨酸Ala脯氨酸Pro

101.48%lgl7%104.39%101.80%102.51%98.45%98.26%97.74%101.42%100.34%99.92%101.50%101.29%101.80%102.59%98.45%1.05%1.%100.80%102.68%102.20%98.76%97.46%96.54%99.34%99.65%酪氨酸Tyr102.04%102.00%98.22%97.80%97.35%96.72%99.72%102.61%102.33%98.78%98.21%97.54%96.07%99.95%0.55%0.22%0.30%0.37%0.45%绮氨酸Vai蛋氨酸Met102.47%99.07%98.38%97.71%99.73%异亮氨酸lie亮氨酸Leu苯丙氨酸Phe98.31%97.44%99.66%104.32%99.75%2.94%0.42%赖氨酸Lyb100.60%100.50%溶液按照按2.4项下的方法平行制备6份氨基酸混合 标准品衍生溶液，按2.1项下色谱条件进行HPLC分

匹配（图2）,并生成对照指纹图谱（图3）o 17批珍珠层 粉指纹图谱自动匹配共得到24个共有峰，其中有一

析，按照2.6项下的线性回归方程计算回收率，16种氨 基酸（胱氨酸Cys除外）的回收率均在95%-105%之

个峰为正亮氨酸内标，所以一共得到23个共有峰，与

氨基酸混合标准品溶液进行对比,指认出15个氨基酸，

间，回收率的RSD值均＜ 3%（表7）。另外两个氨基酸，由于部分批次中的含量太低，未被 冲药色谱指纹图谱相似度评价系统”匹配为共有峰。2.11珍珠层粉氨基酸指纹图谱的建立及共有峰的

鉴定取17批珍珠层粉药材按2.2.2.3项下方法制备供

3数据分析试品衍生溶液，按2.1项色谱条件下检测，记录色谱 图。将所有数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹

3.1珍珠层粉氨基酸指纹图谱数据分析3.1.1指纹图谱的相似度评价利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2012.130723版本）”软件对17批不同基源

图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件进行处

理。选取S1作为参照图谱，选择中位数法生成对照图

谱，时间窗宽度设为0.2,运用自动峰匹配进行全谱峰

和产地的珍珠层粉药材进行相似度评价（表8）o 17批1357〔World. Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕

2019第二十一卷 第七期 ★VoldlNoJ01234567 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

时间/min图2 17批层粉珍珠药材色谱峰匹配图45403530252015-- A 110A

05- ,00一X

95908580757065605550454035302520151050

- -一 -一A 1A

012345678 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

时间/min2: Asp; 4: Glu; 6: Ser; 7: Gly; & Arg; 9: Thr; 10: Ala; 11: Pro; 14: Tyr; 15: Vai; 17: Cys; 1 & lie; 19: Leu; 20: Phe; 21: Lys;图3珍珠层粉药材的共有模式图谱珍珠层粉药材图谱与对照指纹图谱的相似度范围为

均大于0.90,相似度在0.90以上的药材占88.24%,可 见大部分药材质量比较接近，说明药材中氨基酸成分 相似度较高，但可能由于珍珠层粉药材生产过程中受

0.881-0.996,说明珍珠层粉药材的质量存在一定差

异。除了 S1号样品（浙江诸暨2017年）和S11号样品 （浙江诸暨2018年）图谱与对照图谱的相似度小于

到气候、水质、环境等因素以及采收加工过程中诸多因 素的影响,表现出一定的差异。0.90以外,其他各批次药材图谱与对照图谱的相似度

1358〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕世界科学技术一中医药现代化★中药研究3.1.2聚类分析表8珍珠层粉指纹图谱相似度评价运用SAS统计学软件，对17批珍珠层粉样品进行 批次相似度聚类分析，采用离差平方和法脚,以欧氏距离作为样品 SI0.883相似度的测度，以23个共有峰的峰面积为变量（图4）, S20.985当欧式距离如虚线1所示时，可以将17批珍珠层粉分

S30.994为两类;当欧式距离为虚线2所示时，可以将17批珍珠

S40.9776S50.996层粉分为类，第一类为S1 （浙江诸暨2017年）和S11 S60.992（浙江诸暨2018年），第二类为S14（r东湛江）,S15（广 S70.9东湛江）,S16（广东湛江），第三类为S3（浙江诸暨阮市

S80.9922017年），S8 （湖南常德2018年），S9 （浙江诸暨2018

S90.995年）,S17（浙江诸暨阮市2017年），第四类为S5（广东澳 S100.991珍药业170802批次）,S6（广东澳珍药业170803批次）,

Sil0.881S12（浙江诸暨2018年），第五类为S2（浙江诸暨江薄 S120.9772017年），S4（河南信阳罗山2018年），S10（安徽黄山

S130.9882018年），第六类为S7（广东湛江2017年）和S13（广西

S140.995北海）。S150.9S160.996聚类分析结果与相似度评价保持一致,根据聚类

S170.994分析结果可知，第一类均为浙江诸暨三角帆蚌基源，为

淡水珍珠层粉;第二类均为广东湛江所产马氏珍珠贝

基源，为海水珍珠层粉;第三类有浙江和湖南两个地区

三角帆蚌基源,为淡水珍珠层粉;第四类为浙江和广东 SUJenbs jo

两个地区三角帆蚌基源，为淡水珍珠层粉;第五类为浙 uns江，河南，安徽三个地区三角帆蚌基源,为淡水珍珠层

」3s

n粉;第六类为广东和广西两个地区马氏珍珠贝，为海水 ouuu珍珠层粉,通过相似度评价可知,珍珠层粉所含氨基酸

己 UH

成分相似度较高,药材质量比较接近,但是通过聚类分

析，可以明显地看出，不同产地的珍珠层粉氨基酸成分 0SI S11S14S16S15 S3 S9 S8 S17S5S12 S6 S2 S10S4 S7 S13差异不大,但是不同基源（即三角帆蚌和马氏珍珠贝）

Nane of Obseration or Cluster的珍珠层粉氨基酸成分之间存在明显差异。图4 17批珍珠层粉药材聚类分析树状图3.1.3主成分分析表9主成分特征值及方差用SPSS 20.0软件对各共有峰的峰面积进行处理, 方差 累积方差 对17批珍珠层粉药材指纹图谱所得23个共有峰进行

主成分特征值距离贡献率/%贡献率/%主成分分析，求出相关矩阵的特征值及其方差（表9）,

110.0735685.3675060.4380.438共提取出6个主成分，前6个因子的累积方差贡献率达 24.7060622.54096240.20460.26到99.16%,前6个主成分即可代表珍珠层粉指纹图谱

32.16509960.38422940.09410.7367SPSS 20.0进一步将各 41.78087010.59005770.07740.8142共有峰的大部分信息。并通过51.19081250.14130.05180.8659特征向量中心化和标准化后，得到17批样品主成分三

61.04944850.30555010.04560.9116维得分图刚（图5）,根据主成分三维得分图可知，主成 分分析结果与相似度评价和聚类分析保持一致，不同 显的差异。产地的珍珠层粉氨基酸成分区别不大,但是不同基源

主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大 （三角帆蚌和马氏珍珠贝）的珍珠层粉氨基酸成分有明小和作用方向削。由于变量诸多不易分析，因此提取〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 13592019第二十一卷第七期★Vol. 21 No.7上，通过分析“23个共有峰3个主成分的排序坐标图” 来表示（图7）,23个变量对主成分1和主成分3成正相

I

关，而对主成分2有正相关和负相关，其中，对主成分2 S-SA-EUBI呈现正相关，并且贡献率达到0.4以上的有2（天门冬

氨酸Asp）、3、8（精氨酸Arg）、10（丙氨酸Ala）、17（胱氨

酸aCys）、19（亮氨酸Leu）、23号峰，对主成分2呈现负 loos相关，并且贡献率达到0.4以上的有6（丝氨酸Ser）. 9

（苏氨酸Thr）、16、20（苯丙氨酸Phe）号峰,说明了海水

珍珠层粉和淡水珍珠层粉之间差异较大的氨基酸应当 是这些氨基酸，其中天门冬氨酸Asp、精氨酸Arg、丙氨

酸Ala、胱氨酸Cys和亮氨酸Leu对主成分2呈现正相

关，所以推测这5个氨基酸在海水珍珠层粉中的含量 应当高于淡水珍珠层粉中的含量;而丝氨酸Ser、苏氨 酸Thr和苯丙氨酸Phe对主成分2呈现负相关,推测这

3个氨基酸在海水珍珠层粉中的含量应当低于淡水珍

珠层粉中的含量。3.2珍珠层粉氨基酸含量测定数据分析取不同产地和基源的珍珠层粉药材适量，按2.2、

2.3项下方法制备供试品衍生溶液，在2.1项色谱条件

下进行含量测定测定，采用Venusil AA氨基酸分析方 法包中的计算方法得到17批珍珠层粉中17种氨基酸

的含量以及总氨基酸含量（表10）。Venusil AA氨基酸分析方法包氨基酸含量计算方

法：样品溶液中各种氨基酸浓度（pig・mLT）才伍x c,

其中:/「=样品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积必= 混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积,

C =氨基酸对照品浓度（fxg-mL'Oo样品中总氨基酸含量（％）=样品溶液中所有氨基

酸浓度总和（ixg-mL'*） x V x 10 6 x 100/W,其中：V = 样品溶液的定容体积（mL）,W =样品质量（g）由3.1.3项下的主成分分析推测天门冬氨酸Asp、 精氨酸Arg、丙氨酸Ala、胱氨酸Cys和亮氨酸Leu在海

图7 23个共有峰对3个主成分的排序坐标图水珍珠层粉中的含量应当高于其在淡水珍珠层粉中的

含量;丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和苯丙氨酸Phe在海水珍 前三个主成分，根据主成分载荷矩阵得到17批珍珠层

珠层粉中的含量应当低于其在淡水珍珠层粉中的含

粉对3个主成分的排序坐标图（图6）及23个共有峰对

量,经过含量测定,将正相关和负相关氨基酸在海水珍 3个主成分的排序坐标图（图7）。珠层粉和淡水珍珠层粉的含量平均值列于表11、12 由图6可见，海水珍珠层粉和淡水珍珠层粉对3个 中，含量测定的结果与主成分分析完全一致，海水珍珠 主成分的贡献值有很大差异，主要体现在对主成分2

层粉和淡水珍珠层粉的氨基酸成分存在明显差别。的贡献上，批次号为S7,S13,S14,S15,S16的海水珍珠

层粉对主成分2的贡献值最大，说明海水珍珠层粉和 4结论淡水珍珠层粉氨基酸成分的差异主要体现在主成分2

本次研究收集了来自6个省份、两种基源（马氏珍1360〔World. Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica ]世界科学技术一中医药现代化★中药研究表10珍珠层粉中氨基酸的含量测定结果(“ = 3,mg・gT)名称mg-g_1序号Asp天

Glu谷Ser丝 Gly甘 His组Arg精Thr苏Ala丙Pro脯 Tyr酪 Vai绷Met蛋 Cys Lie 异Leu亮 Phe苯 Lys赖 总氨

门冬氨氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸氨酸胱氨酸亮氨酸氨酸丙氨酸氨酸基酸酸0.4192.1592.1201.9190.2841.1621.187SIS2S30.5721.8470.6983.33.5490.0360.10.3391.3050.0840.3163.3393.7000.1260.5240.4670.0911.0530.2210.0090.1070.0100.0160.0200.0160.0120.0260」520.4240.3921.0930.2420.9540.9931.4980.1887.2010.7060.7010.58319.7580.65720.1610.65822.90.2629.7592.0032.3660.1240.2170.0480.2760.0460.0201.3091.3840.3250.48.1734.1880.7390.9610.1080.0350.0250.4650.5080.2130.30.2911.2211.228S4S5S6S71.1410.5290.9540.90..6941.7283.0283.4810.6790.2050.4100.9220.3330.8350.81.7052.4110.8581.4730.6821.3001.5040.1490.2360.1370.1880.1980.3320.0940.4192.3954.2080.3020.1870.6870.4110.6291.1091.3560.7350.4920.8460.5510.0390.0400.0220.13717.1590.417.7110.35211.8051.0411.1173.8782.5032.6573.8663.33.9240.3200.3160.2830.4920.4390.0250.027S81.0051.2571.9792.2872.1250.8390.8410.2900.608S9S100.7251.0761.2011.7480.0780.4180.8050.0850.8430.2920.50.4130.6800.0030.0470.0000.0170.0530.0140.0160.0090.2630.7191.1010.5700.9110.38312.1460.60018.9233.4780.7193.9731.9442.9880.1691.2380.4560.1170.4200.1500.5080.1970.2680.2110.311SilS120.4081.5350.2860.5691.7820.0230.2060.0310.0410.3591.5900.2280.8150.3871.10.2400.9900.3090.5230.1877.2231.1510.4440.8750.6580.9780.8520.6040.1580.3040.0430.0120.62520.2090.22010.306S13S140.9832.0550.4900.7860.0480.1280.0873.1523.5970.3150.4620.3570.5370.5910.8711.2100.8280.9130.5930.8841.4701.3210.9691.3990.2940.1650.0230.0210.39816.045S15S161.2821.8650.0502.5354.1860.2580.3410.40.6220.5520.3720.5520.7480.25610.9710.37317.121

2.2161.2223.2902.8550.0730.0210.1180.4050.2090.0130.0150.0181.357S171」683.3470.4390.3690.9240.45015.444珠贝和三角帆蚌)的17批珍珠层粉，首次建立了珍珠 层粉的氨基酸指纹图谱,并较为全面地分析和测定了

表11正相关氨基酸在海水珍珠层粉和

淡水珍珠层粉中的含量平均值(mg-g1)正相关的氨基酸珍珠层粉中氨基酸的含量。珍珠层粉氨基酸指纹图谱确认了 23个共有峰,并 与氨基酸混合标准品对比，指认出其中15个共有峰，

海水珍珠层粉1.9911.298淡水珍珠层粉1.3541.011Asp天门冬氨酸Arg精氨酸使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析得17批

Ala丙氨酸Cys胱氨酸3.5493.4470.019珍珠层粉药材图谱与对照指纹图谱的相似度范围为

0.0211.1880.881-0.996,相似度在0.9以上的药材占比为88.24%,

说明珍珠层粉药材的质量存在一定差异;通过聚类分 析，将17批珍珠层粉分为6类,通过聚类分析结果，可

Leu亮氨酸正相关的氨基酸0.0淡水珍珠层粉海水珍珠层粉0.8580.1180.500Ser丝氨酸Thr苏氨酸1.346以明显地看出，不同产地的珍珠层粉氨基酸成分差异

0.2520.723不大,但是不同基源(即三角帆蚌和马氏珍珠贝)的珍

Phe苯丙氨酸珠层粉氨基酸成分之间存在明显的差异;运用主成分 分析，建立主成分三维得分图,其结果与聚类分析高度 一致,进一步建立“不同批次珍珠层粉对主成分的排序

分2呈现负相关,并且贡献率达到0.4以上，推测负相

关氨基酸在海水珍珠层粉中的含量应当低于淡水珍珠 层粉中的含量;通过珍珠层粉中氨基酸的含量测定证

坐标图”,发现海水珍珠层粉对主成分2的贡献最大且 均呈现正相关性，通过分析“17种氨基酸对主成分的

实了主成分分析中的推测。以上结果表明，珍珠层粉氨基酸指纹图谱可以反

排序坐标图”，发现天门冬氨酸Asp、精氨酸Arg、丙氨 酸Ala、胱氨酸Cys和亮氨酸Leu对主成分2呈现正相 关,并且贡献率达到0.4以上，推测正相关氨基酸在海

映珍珠层粉药材中氨基酸成分的特征性和整体性， 所建立的珍珠层粉氨基酸含量测定方法具有简便易

行、准确度高的优势，不仅能为珍珠层粉的质量评价 提供依据，同时更有待为中国药典收载珍珠层粉提供

水珍珠层粉中的含量应当高于淡水珍珠层粉中的含 量,发现丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和苯丙氨酸Phe对主成

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杂志,2018, 38(1): 168-174.Construction of Amino Acid Fingerprint and Determination of Amino Acid Content of Pearl Layer PowderQiao Yihan1, Meng Xuedan1, Suo Yaran1, Liu Wenxue1, Li Erwen1, Wang Zhaoyi1,Feng Dan1, Ke Zunhong2, Lin Ruichao1, Zou Dixin(1. Traditional Chinese Medicine Quality Evaluation of the Key Laboratory of Beijing,School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Ch inese Medicine, Beijing 100102, China;2. Chengdu Kanghong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 610036, China;3. Institute of Traditional Chinese Medicine, Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China)Abstract: Objective To establish the fingerprint of amino acid of Chinese medicine pearl layer powder by HPLC, to study

the pattern recognition of fingerprint, and to determine the content of amino acid in pearl layer powder to provide basis for the quality evaluation of pearl layer powder. Methods Venusi 1—AA amino acid analysis column (4.6 mm x 250 mm,

5 column number: AA952505-0), column temperature: 28^, sample volume: 10 |1L, wavelength: 254 nm, flow rate:

0.9 mL • min_1, sodium acetate solution with pH 6.5 as mobile phase A and 80% acetonitrile solution as mobile phase B

were used. Cluster analysis and principal component analysis were carried out by SAS and SPSS statistical software to study the pattern recognition of pearl layer powder fingerprint. Results The amino acid fingerprint of pearl layer powder

and the common pattern of amino acid fingerprint were established. 23 common peaks were obtained and 15 of them were

identified. The results of similarity analysis are consistent with those of cluster analysis and principal component analysis. There was no significant difference in amino acid composition of pearl layer powder from different habitats, but

amino acid composition of pearl layer powder with different origins was obviously different. The contents of 17 kinds of

amino acids (Asp, Glu, Ser, Gly, His, Arg, Thr, Ala, Pro, Tyr, Vai, Met, Cys, lie, Leu, Phe, Lys) in 17 batches of pearl

layer powder are obtained. Conclusion The established fingerprint analysis method of amino acids in pearl layer powder

has strong specificity. Content determination method of the amino acid is simple, accurate and reliable. It can provide a basis for the quality evaluation of pearl layer powder.Keywords: Pearl layer powder, Amino acid fingerprint, Determination of amino acid content, Cluster analysis, Principal

component analysis(责任编辑：周阿剑，韩紫欣;责任译审：邹建华。)〔World, Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1363