第23卷第4期 天津农学院学报 、b1.23,No.4 2016年l2月 Journal ofTianjin Agricultural University December,2016 文章编号:1008—5394(2016)04—0028—05 牛蒡子中牛蒡苷的超声提取工艺优化研究 刘称 ,王英超¨'通信作者,金红la马晓雨la史雪艳h (1.天津农学院a.农学与资源环境学院,b.基础科学学院,天津300384) 摘要:利用超声法对牛蒡苷最佳提取条件进行优化研究。考察超声功率、超声时间、超声温度、 料液比等因素对牛蒡苷提取率的影响,并采用正交试验优化提取条件。结果表明:粒径为100目、 提取溶剂为95%乙醇、预浸泡时间2 h、料液比1:150(g:mL)、超声时间45 min、超声功率 114 W、超声温度70℃为最佳提取条件。在最佳提取条件下,进行了3组平行验证试验,牛蒡苷 的平均提取率为12.69%。与其他超声提取工艺相比,牛蒡苷提取率至少提高1.89%。 关键词:牛蒡子;牛蒡苷;含量测定 中图分类号:R284.2 文献标识码:A Study 0n the Extraction Conditions Of Arctiin in Ultrasonic Method UChe a. ArNGYing-chaolb,Conesporiding th ,JlNHon 。,MAXiao-yuk,SHIXue-yan1n (1.TianjinAgricultural Universiyt,a.College ofAgronomy and Resource Environment,b.College ofBasic Science,Tinajin 300384,China) Abstract:The optimal extraction condition of arctiin was studied by ulrtasonic method.The newly fresh seed of hte Arctium lappa was used to investigate the effects of hte ulrtasonic power,ulrtasonic time,ulrtasonic temperature,solid-liquid ratio and Other factors on the extraetion rate of arctiin.Orthogonal experiment was performed to optimize the extraction conditions.The results showed that the crush size was 100 mesh,extraction solvent was 95%ethanol,pre-soaking time WaS 2 h,material liquid ratio was 1:150(g:mE),ultrasonic time was 45 rain,ulrtasonic power was 114 ulrtasonic temperature was 70℃as hte optimum extraction conditions.The three paralle1 tests were carried out under the optimum extraction conditions,the average extraction rate obtained for arctiin was 12.69%.Compared witll other ultrasonic extraction process.arctiin yield was increased at least 1.89%. Key words:the seeds ofthe Arctium lappa;arctiin;content determination 牛蒡子(Arctium lappa L.)为菊科植物牛蒡 取时间、提取温度等因素对牛蒡苷及牛蒡苷元提 的干燥成熟果实 】。牛蒡苷为牛蒡子的主要有效成 取率的影响,得到牛蒡苷的提取率为9.24%。吴 分 ,具有免疫调节、抗菌、抗病毒等多种生理 杨等采用正交试验的方法,对牛蒡子的超声提取 功能嘲。常见牛蒡苷的提取方法有加热回流法 、 工艺进行优化。选择乙醇浓度、乙醇倍数、提取 超临界萃取法 。加热回流法的提取时间一般较 时间和粉碎粒度4个因素,采用L9(3 )进行正 长,提取效率低;而超临界萃取法须将极性较大 交试验,所得牛蒡苷的提取率为10.8%。上述提 的牛蒡苷水解为极性较小的牛蒡苷元才能提取的 取工艺所得牛蒡苷提取率较少,小于l1%,且研 较为完全,提取步骤比较繁琐。超声波作为一种 究多集中在对超声的参数设置上,对于原材料牛 有效的提取技术,具有简单、高效、低成本的特 蒡子的筛选及用提取溶剂预浸泡牛蒡子粉末未见 点,越来越多的应用于天然产物的提取中。 文献报道。笔者在前人研究的基础上,利用超声 关于牛蒡苷超声提取工艺研究报道较少,仅 法提取牛蒡苷,通过前期对牛蒡子筛选除杂及用 见武娟霞等 和吴杨 蝴利用超声工艺提取牛蒡 提取溶剂预浸泡牛蒡子粉末,增加与溶剂的接触 苷的研究。武娟霞等利用超声法提取牛蒡子中牛 时间,并考察超声功率、温度等因素对牛蒡苷提 蒡苷和牛蒡苷元,考察了超声功率、液固比、提 取率的影响,以期得到较高提取率的牛蒡苷提取 收稿日期:2016—03—11 基金项目:天津市大学生创新创业训练计划项目“牛蒡子中牛蒡子苷的提取方法比较、优化及其利用”(20151006105);天津市科技支 撑项目“枣活性成分功效研究及产品开发”(1 1ZCKFNCO1600) 作者简介:刘称(1993一),女,天津市人,本科在读,主要从事生物分离与提取研究。E-mail:376147823@qq.tom。 通信作者:王英超(1981-),女,天津市人,实验师,硕士,主要从事生物化学实验教学与生物分离方面的研究。E-mall:shibiology@163.conl。 第4期 刘称,等:牛蒡子中牛蒡苷的超声提取工艺优化研究 工艺,为牛蒡苷在食品及药品方面的开发利用提 供参考。 1材料与方法 1.1材料 牛蒡子:购自甘肃省陇西。挑选外观整齐一 致,颗粒饱满的牛蒡子,水洗除去泥土等杂质, 60℃烘干4h,备用。 1.2试剂 95%乙醇(分析纯)、无水乙醇(分析纯)购 自天津市风船化学试剂科技有限公司;甲醇(色 谱纯)购自Fisher Scientiifc;乙酸乙酯、丙酮购白 天津市江天化工技术有限公司;牛蒡苷标准品(纯 度>96%)购自中国食品药品检定研究院(批号: 1 10819—201510)。 1.3仪器与设备 1200 Series Agilent高效液相色谱仪(美 捷伦科技有限公司);FA一2004电子天平(上海方 瑞仪器有限公司);Milli—Q Advantage A10超纯水 仪(美国密理博(中国)有限公司);ElmasonicP 超声波清洗器(380 W,德国艾尔玛公司);L550 低速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。 1.4方法 1.4.1粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响 选取40、60、80、100、120目的牛蒡子粉末 各0.2 g,按料液比1:150(g:mL)加甲醇30mL 于50 mL三角瓶中,304 W超声提取20 min。待 提取结束后,4 000 r/min离心5 min。上清液过 O.22岫有机滤膜,滤出液作为高效液相色谱仪进 样样品使用。以牛蒡苷的提取率为评价指标,探 讨不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响。牛蒡苷 的提取率(%)=样品中牛蒡苷的含量(mg/mL)× 提取液总体积(mL)×100÷取样量(g)÷1 000。 1.4.2溶剂对牛蒡苷提取率的影响 选取100目的牛蒡子0.2 g,按料液比1:150 分别加入甲醇、无水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、 丙酮于各个三角瓶中进行超声提取,功率304 W, 时间35 min。后续操作按照1.4.1中的方法进行, 探讨不同的提取溶剂对牛蒡苷提取率的影响。 1.4-3预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响 选取100目的牛蒡子粉末0.2 g,按料液比 1:150加入30mL95%乙醇,按照预浸泡时间0、 2、4、6、12、24 h对牛蒡子粉末进行处理。待预 浸泡相应时间后,304 W功率下超声35 min,后 续操作按照1.4.1中的方法进行,探讨不同的预浸 泡时间对牛蒡苷提取率的影响。 1.4.4超声时间对牛蒡苷提取率的影响 选取100目的牛蒡子粉末0.2 g,按料液比 1:150加入30mL95%乙醇,预浸泡时间2h,304W 功率下分别超声15、25、35、45、55 min,后续 操作按照1.4.1中的方法进行,探讨不同的超声时 间对牛蒡苷提取率的影响。 1.4.5超声温度对牛蒡苷提取率的影响 选取100目的牛蒡子粉末O.2 g,按料液比 1:150加人30mL95%乙醇,预浸泡时间2h,304W 功率下分别在4O、50、60、70、8O℃下超声35 min, 后续操作按照1.4.1中的方法进行,探讨不同的温 度对提取牛蒡苷率的影响。 1.4.6超声功率对牛蒡苷提取率的影响 选取100目的牛蒡子粉末0.2 g,按料液比 1:150加人30mL95%乙醇,预浸泡时间2h,温 度70℃。超声功率按照最大功率380W的30%、 40%、50%、60%、70%tip 1 14、152、190、228、 266W下超声35min,后续操作按照1.4.1中的方法 进行,探讨不同的超声功率对牛蒡苷提取率的影响。 1.4.7料液比对牛蒡苷提取率的影响 选取100目的牛蒡子粉末,按照料液比 1:300、1:150、1:50、1:30、1:20加入95% 乙醇,预浸泡时间2 h,温度70℃,超声功率152 w功率下超声35 min,后续操作按照1.4.1中的方 法进行,探讨不同料液比对牛蒡苷提取率的影响。 1.4.8色谱条件 分离柱:Agilent XDB—C18(4.6 mm×50 mm, 1.6 1.tm);流动相:甲醇一水(V甲醇:V水=1:1.1); 流速:0.5 mL/min;检测波长:280 nm;柱温: 25 oC;进样量:5 lxL。 1.4.9牛蒡苷标准曲线的制作 将1.5 mg/mL的牛蒡苷标准品稀释成浓度为 0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mg/mL,按照其上述 色谱条件进行试验,以峰面积为纵坐标,牛蒡苷 的浓度为横坐标绘制标准曲线。 1.4.1O正交试验 以单因素试验为基础,选择超声温度、功率、 料液比、超声时间4因素,进行4因素3水平正 交试验设计,见表1。 天津农学院学报 第23卷 表1 4因素3水平正交试验设计 亚 因素 ■’- 温度M ̄C功率B/W料液比C/(g:mL)时间D/min 1 6O 114 l:300 25 2 70 152 1:150 35 3 80 190 1:100 45 1.4.11数据统计分析 采用Excel 2003和SPSS13.0软件进行数据处 理和分析。 2结果与分析 2.1牛蒡苷标准曲线 牛蒡苷标准曲线见图1。从图1可以看出,牛 蒡苷标准曲线方程:Y=1 714.8x+25.031, : 0.999 I。y代表峰面积,X代表牛蒡苷浓度(mg/mL)。 3 2萤 牛蒡甘浓度,Hlg・mI.,-’ 图1牛蒡苷标准曲线 2.2牛蒡苷标准品及样品液相色谱图 牛蒡苷标准品液相色谱图及样品色谱图分别 见图2和图3。从图2看出,0.5 mg/mL牛蒡苷标 准品的保留时间在2.904 min,其他峰为未知样品。 样品超声提取后,40130 r/min离心10rain,取上 清液定容至10 mL,经0.22 1.tm有机滤膜过滤后, 取10 上样。从图3可以看出,样品中牛蒡苷 的保留时间在2.886 min,牛蒡苷的特征吸收波长 为280 nm。本试验色谱条件采用武娟霞等 的方法 进行,在此条件下进行色谱分析,得到牛蒡苷的 峰形对称性良好,基线平稳,与杂质峰分离良好, 无杂峰干扰,方法可行。 2.3不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响 不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响见图4。 由图4可知,牛蒡苷的提取率呈现先上升后下降 的趋势。粉碎粒径为100目时,牛蒡苷的提取率 最大,为11 ̄40%。40、60和80目的牛蒡子因为 粒径较大,牛蒡苷不易提取完全;牛蒡子粒径过 小,表面积增加,可能吸附了一部分牛蒡苷 ”, 导致提取率降低,所以选择粉碎粒径为100目。 粒 目 图4不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响 2.4不同的溶剂对牛蒡苷提取率的影响 不同的溶剂对牛蒡苷提取率的影响见图5。由 图5可知,牛蒡苷的提取率大小为95%乙醇、丙酮、 无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯。丙酮、甲醇由于具有 一定的毒性,不能作为牛蒡苷提取的溶剂。无水乙 醇和95%乙醇下牛蒡苷的提取率均较高,且提取剂 安全无毒。牛蒡苷用极性较大的高浓度的乙醇进行 提取时提取率较高 ,这与本试验结果相一致。综 上,选择95%乙醇作为牛蒡苷提取溶剂。 f_甲醇.无水乙醇_.95%乙醇 -。丙酮 1.乙酸乙酯 _。 溶剂 图5不同的溶剂对牛蒡苷提取率的影响 2.5预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响 预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响见图6。由 图6N知,预浸泡时间2 h时牛蒡苷的提取率最大, 第4期 刘称,等:牛蒡子中牛蒡苷的超声提取工艺优化研究 为12.21%。随着时间的延长,牛蒡苷的提取率变 化不大。未浸泡的牛蒡子中牛蒡苷提取率较小。 适当的浸泡时间能够促使牛蒡苷更多的溶解到提 取溶剂中。而浸泡时间过长,牛蒡子中的牛蒡苷 2.8超声功率对牛蒡苷提取率的影响 超声功率对牛蒡苷提取率的影响见图9。由图 9可知,超声功率在152 w时,牛蒡苷的提取率 达到最大1 1.66%。随着超声功率增加,牛蒡子中 牛蒡苷的提取率有所下降,这可能是因为超声功 提取率与浸泡2 h相比,差异不大。因此,综合考 虑能源、效率等因素,选择为预浸泡时间2 h。 率过大,热效应增强,牛蒡苷的内酯键易遭破 预授泡时间/h 图6预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响 2.6超声时间对牛蒡苷提取率的影响 超声时间对牛蒡苷提取率的影响见图7。由图 7可知,超声时间为35 min时,牛蒡苷的提取率 最大,为12.59%。超过35min后,牛蒡苷的提取 率下降至8.54%。这是由于超声时间较短,牛蒡 苷未被完全提取。超声时间过长,由于超声波的 热效应,容易引起部分内酯键的破坏 ,且能耗 增加。所以最佳超声时间为35 min。 超声时间/min 图7超声时间对牛蒡苷提取率的影响 2.7超声温度对牛蒡苷提取率的影响 超声温度对牛蒡苷提取率的影响见图8。由图 8可知,牛蒡苷提取率随温度升高而增加,当温度 达到70℃时,提取率最大,达到12.61%,80℃ 时提取率下降至11.1%。温度太高,提取溶剂易 挥发,降低提取效率,因此选择超声温度为70℃。 超声温度,℃ 图8超声温度对牛蒡苷提取率的影响 坏 ,所以最佳超声功率为152 w。 超声功率,w 图9超声功率对牛蒡苷提取率的影响 2.9料液比对牛蒡苷提取率的影响 料液比对牛蒡苷提取率的影响见图10。由图 10可知,随着料液比的增加,牛蒡苷的提取率在 料液比1:150时达到最大值,为10.16%,之后 降低。主要是因为前期溶剂量越大,有效成分浸 出越完全,提取率也就越大。但当溶剂过大时, 超声能量对沉滞在底层的牛蒡子颗粒的机械效应 的强度减弱,从而影响超声提取的效果,同时会 造成溶剂和能源的浪费,并给后序的浓缩工作带 来困难,造成牛蒡苷的提取率减少n ,所以选择 1:150为最佳料液比。 料投}E,g:mL 图1O不同的料液比对牛蒡苷提取率的影响 2.10正交试验法优化试验 在前期单因素试验结果的基础上,通过正交 试验设计优化超声波提取牛蒡苷工艺条件。选择 超声温度、功率、料液比和时间4因素做正交试 验,结果见表2。由表2中极差分析可知,对牛蒡 苷提取率的影响因素从大到小依次为超声温度、 料液比、超声功率 超声时间。说明超声温度对 牛蒡苷提取率的影响最大,是主要因素。其次是 ・32・ 天津农学院学报 第23卷 料液比、功率和时间。提取条件的优化组合为 A:B C Ds,最佳提取条件为超声温度70℃、超声 功率114 W、料液比1:150(g:mL)和超声时 间45 min。在此提取条件下进行3组平行验证试 均提取率为12.69%,高于武娟霞等 和吴杨等 研 利用超声工艺提取牛蒡苷提取率。 参考文献: 验,得出平均提取率为12.69%。 3讨论与结论 市售牛蒡子质量不一,多含有小石子、土块、 残存的叶片等杂质,在试验前必须进行筛选除杂, 否则影响牛蒡苷的提取率。本研究在试验前期,对 牛蒡子进行水洗、除杂,去除了一些不成熟的牛蒡 子和小石子等杂质,确保了试验结果的准确性。采 用一定粒度的牛蒡子粉末在超声前进行预浸泡处 理,增加了牛蒡子粉末与溶剂的接触时间,浸泡后 再进行超声处理,能够显著增加牛蒡苷的提取率。 预浸泡不消耗能源,是一种能够有效增加提取物含 量的一种处理方式。经过优化处理,牛蒡苷最佳提 取工艺条件为提取溶剂为95%乙醇、预浸泡时间 2h、料液比1:150(g:mL)、超声时间45min、 超声功率152 W、超声温度70℃。在最佳提取条 件下进行了3组平行验证试验,得到牛蒡苷的平 [1许亮,窦德强,康廷国.牛蒡子本草考证及道地变 1]迁[J].现代中药研究与实践,2010,24(1):24—26. 【2]Cho M K,Jang Y P,Kim Y C,et a1.Arctigenin,a phenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan,inhibits MAP kinases and AP-1 activation via potent MKK inhibition:the role in TNF-alpha inhibition[J]./nt Immunopharmacol,2004,4(10/11):1419—1429. [3】Kim S H,Jang Y P,Sung S H,et a1.Hepatoprotective dibenzylbutyrolactone lignans of Torreya nucifera against CCh-induced toxicity in ̄m.ry cultured rat hepatocytes[J]. BiolPharm BoB,2003,26(8):1202—1205. [4]王潞,赵烽,刘珂.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药理作 用研究进展[J].中草药,2008,39(3):467-470. 【5】木海鸥,金玉琴,王怡娟.不同因素对牛蒡子成分煎 出量的影响[J】.浙江中西医结合杂志,2010,20(11): 710—712. [6]符林春,徐培平,刘妮,等.牛蒡子苷元复方抗流感 病毒的实验研究[J].中药新药与临床药理,2008,19 (4):266—269. [7】王小琳,张玉杰,石任兵.正交实验设计优选牛蒡子 的提取工艺[J】.北京中医药大学学报,2003,26(4): 64-65. 【8]董文洪,刘本.超临界流体萃取牛蒡子中牛蒡子苷的 实验研究【J】.中国中药杂志,2006,31(15):1240—1241. [9】武娟霞,王志祥,余祥英,等.牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷 元的超声提取工艺研究【J].中成药,2010,32(6):927—930. [10】吴杨,周坚,闵春艳,等.多指标正交试验优化牛蒡 子提取工艺研究『J].世界中西医结合杂志,2015,10 (1):40—42. [11]贺建东,付廷明,郭立玮.湿式超微粉碎提取三七总 皂苷及粒径对提取率的影响[J].世界科技研究与发 展,2008,30(6):706—708. [1 2]鞠玫君.牛蒡子中木脂素类成分的提取工艺研究[D]. 大连:辽宁中医药大学,2008. [13]谢捷,李红娟,朱兴一,等.响应面法优化闪式提取 牛蒡苷的工艺优化[J].食品科学,2010,31(24): 33—36.