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鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的实验研究

来源：测品娱乐

分类号学号

R967 2002010295

密级公开学校代码 90031

硕士学位论文

鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW2.7细胞内

毒素耐受的实验研究

杨雅

指导教师导师组成员培养单位

夏培元教授

第三军医大学西南医院药剂科

药理学 2013年5月

申请学位类别硕士学术学位专业名称论文提交日期

2013年5月

论文答辩日期

吕晓菊

周远大,饶贤才

答辩委员会评阅人

二〇一三年五月

缩略语表..............................................................................................................................1 英文摘要..............................................................................................................................3 中文摘要..............................................................................................................................8 论文正文鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的实验研究

................................................................................................................................12

第一章前言......................................................................................................12 第二章 CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究..15

2.1 材料与试剂...................................................................................................15 2.2 实验方法......................................................................................................16 2.3 结果......................................................................................................21 2.4讨论.......................................................................................................23 第三章 CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的分子机制研究.....................26

3.1 材料与试剂...................................................................................................27 3.2 实验方法......................................................................................................28 3.3 结果......................................................................................................35 3.4 讨论......................................................................................................41 全文结论.....................................................................................................................44 参考文献.....................................................................................................................45 文献综述内毒素耐受研究进展......................................................................................50

参考文献.....................................................................................................................57 研究生期间论文情况..........................................................................................................65 致谢.............................................................................................................................66

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缩略语表

英文缩写 BSA CCL3

CLP Ccyclic CXCL10

DEPC Ddiethypyrocarbonate DMEM E.coli Escherichia ELISA ENP ERK

ET Endotoxin FITC Ffluorescein G- Ggram-negative G+ Ggram-positive GM-CSF Granulocyte-macrophage HA Haluronic ICAM IDR

IFN Interferon IκB I-kappa-B-alpha IL Iinterleukin

IL-1RA Iinterleukin-1 IRAK IRF3 JNK

LALF Llimulus

英文全称

Bbovine serum albumin Cchemokine ligand 3

Limulus peptide Recombinant Mouse IP-10

Dulbecco's Modified Eagle Medium coli

Eenzyme linked immunosorbent assay Endotoxin neutralizing protein Eextracellular signal-regulated kinases

tolerance isothiocyanate bacteria bacteria colony-

stimulating factor

acid Iintercellular adhesion molecule Iinnate defense regulator

receptor antagonist Iinterleukin-1 receptor-associated kinase4 Interferon regulatory factor 3 C-Jun N-terminal kinases

anti-lipopolysaccharide factor

中文对照牛血清白蛋白趋化因子配体3 环状鲎肽趋化因子受体10 焦碳酸二乙酯

Dulbecco 改良 Eagle 培养基大肠埃希氏菌酶联免疫吸附法内毒素中和蛋白细胞外信号调节激酶内毒素耐受异硫氰酸荧光素革兰阴性细菌革兰阳性细菌

巨噬细胞集落刺激因子

透明质酸细胞间粘附分子天然防御调节因子1 干扰素

核因子kB抑制蛋白α亚基白细胞介素 IL-1受体拮抗物白介素-1受体相关激酶干扰素调节因子3 c-Jun氨基末端激酶美洲鲎抗内毒素因子

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LPS Li popolysaccharide 内毒素

MAPK MCP MIC M-MLV MODS mRNA

MyD88 MmydoidMyD88 NF-κB Nnuclear NO Nnitric NS Nnormal PAMAs

PBMC Pperipheral PBS Pphosphate PMB Ppolymyxin PMSF Phenylmethylsulfonyl PRR RT-PCR

SIRS STAT

TALF Tachypleuss TGF-β Ttransforming Th1 Th2 TLR TNF Tumour TRAF6

WB Western

Mitogen-activated protein kinase 促原活化蛋白激酶 Mmonocyte chemoattractant protein 单核细胞趋化蛋白 Minimal inhibitive concentration 最低抑菌浓度

Moloney Murine Leukemia Virus 莫洛尼小鼠白血病病毒 Mmultiple organ dysfunction syndrome 多器官功能障碍综合征 Mmessenger ribonucleic acid

信使核糖核酸髓样细胞分化因子88 factor- κB 核转录因子κB oxide 一氧化氮 saline 生理盐水

Pathogen-associted molecular patterns

病原相关分子模式

blood monouclear cells 外周血单核细胞 buffered saline 磷酸盐缓冲盐水 B

多粘菌素B fluoride 苯甲基磺酰氟 Ppattern recognition receptors

模式识别受体

Reverse Transcription Polymerase Chain 逆转录聚合酶链式反应 Reaction

Systemic inflammatory response syndrome全身炎症反应综合征 Signal transducers and activators of 信号传导及转录激活因子 transcription

anti-lipopolysaccharide factor 东方鲎抗内毒素因子 growth factor-β 转化生长因子-β Helper T cell 1 T辅助细胞1 Helper T cell 2 T辅助细胞2 Ttoll like receptor

Toll样受体 Necrosis Factor 肿瘤坏死因子

TNF receptor-associated factor 6

小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6Blotting

免疫印迹法

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The induction of Limulus anti-endotoxin factor mimetic peptide CLP-19 to endotoxin tolerance in RAW2.7 cells

Abstract

Sepsis is a common clinical critical illness, which is a systemic inflammatory response syndrome(SIRS) caused by infection, leaving characteristics with high incidence and mortality. Lipopolysaccharide (LPS), also known as endotoxin, one of the major components that presents in the cell membrane of Gram-negative bacteria, not only lead to sepsis，but also can induce endotoxin tolerance which reduce the inflammatory response of a variety of causes for preventing the occurrence of potential sepsis. Endotoxin tolerance (ET) is a phenomenon that cells or organisms exposed to low concentrations of endotoxin (e.g. LPS) enter into a transient unresponsive state and are unable to respond to further challenges with endotoxin. In other words, they develop a kind of ‘‘tolerance’’ to endotoxin. However, it is dangerous that the way preventing the potential sepsis through endotoxin tolerance induced by pretreating with minute amounts of endotoxin，So new strategies should be developed looking for a drug that can induce endotoxin tolerance and reduce inflammatory response.

In our pervious studies, a cyclic Limulus anti-endotoxin factor mimetic peptide CLP-19 was obtained through analyzing the structural characteristics of functional area of limulus anti-lipopolysaccharide factor (LALF) deriving from an amoebocyte of blood cells in horseshoe crab. CLP-19 has antibacterial activity and no haemolyticus and immunogenicity. A good security of CLP-19 was displayed Both in vitro and in vivo. Pretreatment of CLP-19 for 20h can efficiently protect mice from acute peritonitis caused by E. coli. bacteria and significantly suppress elevated TNF-α level stimulated by IL-1β, a cytokine with different structures with LPS. Pretreatment of CLP-19 for 20h also significantly reduce the amount of bacteria in acute peritonitis mice induced by E. coli. Pretreatment with CLP-19 30min can significantly suppress elevated TNF-α level which induced by LPS in cell, The results indicated that CLP-19 may induce endotoxin tolerance.

In order to determine the function and molecular mechanisms of endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells, the model of endotoxin tolerance was established

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and the change of mRNA and protein of critical factor in the inflammatory signaling pathways of RAW2.7 cells was analysized using RT-PCR and Western Blotting.

Methods

1. The time and dose effects of endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells 1.1 The time and dose effects of endotoxin tolerance induced by LPS in RAW2.7 cells by ELISA analysis

RAW2.7 cells were pretreat LPS with different concentrations (0 ng/ml、0.05ng/ml、0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、7 ng/ml、10 ng/ml) for different times (10h, 20h, 24h), then were washed with PBS and cultured with fresh medium for 2h. Cells were treated with LPS of 10ng/ml for 4h. The supernatant was collected and TNF-α release was measured by ELISA.

1.2 The time and dose effects of endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells by ELISA analysis

RAW2.7 cells were pretreat CLP-19 with different concentrations (0 µg/ml, 0.1µg/ml, 1 µg/ml, 5 µg/ml, 10µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml) for different times (10h, 20h, 24h), then were washed with PBS and cultured with fresh medium for 2h. Cells were treated with LPS of 10ng/ml for 4h. The supernatant was collected and TNF-α and IL-10 release was measured by ELISA.

2. The molecular mechanism of endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells

2.1 RT-PCR analysis of TLR4、myD88、TRAF6 gene expression in RAW2.7 cells induced endotoxin tolerance by CLP-19

Pretreated with CLP-19 (50µg/ml ) for 20h, RAW2.7 cells were washed with PBS and then cultured with fresh medium for 2h. RAW2.7 cells were re-treated with LPS of 10ng/ml for diferent time (0h, 1h, 3h, 6h, 12h), the total RNAs were extracted. The mRNA expressions of TLR4, myD88 and TRAF6 were measured with RT-PCR. Meanwhile, the pretreatment of RAW2.7 cell by medium and LPS(5ng/ml) were served as controls , respectively.

2.2 western Blot analysis of TLR4 protein expression existing in the cell intracellular and membrane in after RAW2.7 cells endotoxin tolerance inducing by CLP-19

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Pretreated CLP-19 (50µg/ml ) for 20h, RAW2.7 cells were washed with PBS, cultured with fresh medium for 2h and then treated with LPS of 10ng/ml for 4h. The total proteins were extracted and TLR4 protein expression existing in the intracellular and membrane were measured with Western Blot. the pretreatment of RAW2.7 cell with medium and LPS (5ng/ml) were served as controls , respectively.

2.3 Western Blot analysis of p-P38 phosphorylation pathways in RAW2.7 cells after endotoxin tolerance induced by CLP-19.

Pretreated with CLP-19 (50µg/ml ) for 20h, RAW2.7 cells were washed with PBS, cultured with fresh medium for 2h and then treated with LPS of 10ng/ml for diferent time (0min, 10min, 30min, 60min). The total protein was extracted and p-P38 of MAPK phosphorylation pathways were measured by Western Blot. The pretreatment of RAW2.7 cell with medium and LPS(5ng/ml) were served as controls , respectively.

2.4 Western Blot analysis of IκB protein expression in RAW2.7 cells induced endotoxin tolerance by CLP-19.

Pretreated with CLP-19 (50µg/ml ) for 20h, RAW2.7 cells were washed with PBS, cultured with fresh medium for 2h and then treated with LPS of 10ng/ml for diferent time (0min, 10min, 30min, 60min). The total protein was extracted and IκB protein expression were measured by Western Blot. the pretreatment of RAW2.7 cell with medium and LPS(5ng/ml) were served as controls , respectively.

Results

1. The time and dose effects of endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells

Pretreatment with LPS (5ng/ml) for 20h was the best dose and time for endotoxin tolerance induced by LPS in RAW2.7 cells, while pretreatment with CLP-19(50µg/ml) for 20h was the best dose and time for endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells. Compared with the pretreatment of medium, the expression of TNF-α was no significant difference after endotoxin tolerance induced by LPS and CLP-19, respectively (P>0.05). While compared with endotoxin tolerance inducing by LPS, the expression of TNF-α was significant increased after endotoxin tolerance inducing by CLP-19(P<0.01).

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2. The molecular mechanism of endotoxin tolerance induced by CLP-19 in RAW2.7 cells

2.1 The mRNA expression of TLR4, myD88 and TRAF6 after endotoxin tolerance induced by CLP-19

TLR4 mRNA expression was reduced, while MyD88 and TRAF6 mRNA expression did not significantly change in RAW2.7 cells after endotoxin tolerance induced by CLP-19 compared with the pretreatment of medium (P<0.01).

2.2 TLR4 protein expression of cell intracellular and membrane was decreased after endotoxin tolerance induced by CLP-19

Compared with the of pretreatment of medium, TLR4 protein expression were reduced, not only in cell intracellular but also in cell membrane in RAW2.7 cells after endotoxin tolerance induced by CLP-19 (P<0.05).

2.3 P38 of MAPK phosphorylation pathways was suppressed after endotoxin tolerance inducing by CLP-19

The phosphorylation level of P38 was significantly increased after restimulation with LPS in the cell of pretreatment of medium, while the phosphorylation level of P38 were significantly suppressed after endotoxin tolerance induced by CLP-19 compared with the pretreatment of medium (P<0.05).

2.4 The protein expression of IκB was not degradated after endotoxin tolerance induced by CLP-19

Pretreatment of medium, IκBα and IκBβ were rapidly degraded within 30 min and 60 min after restimulation with LPS (P<0.05). While IκBα and IκBβ were not degraded after endotoxin tolerance induced by CLP-19 compared with the pretreatment of medium (P>0.05).

Conclusions:

1. Limulus anti-endotoxin factor mimetic peptide CLP-19 can induce endotoxin tolerance through reducing protein expression of TLR4 of cell membrane.

2. Limulus anti-endotoxin factor mimetic peptide CLP-19 can induce endotoxin tolerance through inhibiting P38 phosphorylation.

3. Limulus anti-endotoxin factor mimetic peptide CLP-19 can induce endotoxin

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tolerance through inhibiting the degradation of IκBα and IκBβ and thereby inhibiting NF-κB translocation into the nucleus.

Keywords: Limulus anti-lipopolysaccharide factor modeling peptide CLP-19;

AW2.7 cell；Lipopolysaccharide;Sepsis;TNF-α;TLR4; IκB;P38;NF-κB

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鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导小鼠巨噬细胞

RAW2.7内毒素耐受的实验研究

摘要

研究背景及目的：

脓毒症(Sepsis) 是临床上一种常见的危重病症，是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，具有发病率高、死亡率高的特点。作为革兰氏阴性菌细菌细胞壁外层的主要成分之一的内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)除了能引发脓毒症外，还可通过诱导“内毒素耐受”，降低各种原因引起的炎症反应，从而预防潜在脓毒症的发生。内毒素耐受是指动物或免疫细胞等在给予小剂量LPS预处理后，对LPS再次刺激时无反应或反应性明显降低。因此，寻找一种可诱导内毒素耐受同时又不诱导机体产生炎性反应的药物是抗感染及抗炎药物研究的新策略。

环状鲎肽(Cyclic limulus peptide，CLP-19)是经美洲鲎抗内毒素因子(Limulus anti-lipopolysaccharide factor, LALF)结构改造后得到的一条无溶血性、对巨噬细胞等无致炎作用的环肽，具有较理想中和LPS及抗菌活性。课题组前期研究表明，提前给予CLP-19可显著降低血清肿瘤坏死因子-α (Tumour Necrosis Factor, TNF-α)水平、提高大肠杆菌致急性腹膜炎模型鼠的生存率；预防性给予CLP-19能显著减少大肠杆菌致急性腹膜炎模型鼠体内的细菌量。在细胞水平，CLP-19预刺激30 min后，以磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline, PBS)清洗细胞，再用LPS进行刺激，结果发现，CLP-19预处理组同样可显著降低LPS刺激所引起的TNF-α的升高。上述现象表明，CLP-19可诱导“内毒素耐受”，然而其机制有待深入研究。

因此，为明确CLP-19诱导内毒素耐受效应及分子机制，本实验通过建立RAW2.7细胞内毒素耐受模型，利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、免疫印迹法(Western Blotting, WB)等比较研究巨噬细胞炎症信号通路中关键因子的mRNA及蛋白的变化，初步探讨CLP-19诱导内毒素耐受的分子机制。通过以上研究，拟明确CLP-19诱导小鼠“内毒素耐受”的作用及其途径，并为其用于脓毒症预防提供理论依据。

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实验方法：

第一部分：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究 1. ELISA分析LPS诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应

不同浓度(0 ng/ml、0.05ng/ml、0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、7 ng/ml、10 ng/ml)的LPS作用于RAW2.7细胞，培养不同时间(10h、20h、24h)后，新鲜培养基培养2h，再给予10ng/ml的LPS作用于细胞，4h后取上清液，酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)观察不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量，从而确定LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。

2. ELISA分析CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应

用不同浓度(0 µg/ml、0.1µg/ml、1 µg/ml、5 µg/ml、10µg/ml、20 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml)的CLP-19作用于RAW2.7细胞，培养不同时间(10h、20h、24h)后，新鲜培养基培养2h，再加入LPS使其终浓度为10ng/ml，4h后取上清液，测定不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量和IL-10的表达量，从而确定CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。以LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量为对照组。

3. CLP-19诱导内毒素耐受后IL-6和IL-10表达变化

分别以5 ng/ml LPS、50 µg/ml CLP-19孵育细胞20h，用PBS反复清洗后以新鲜培养基培养2h，再加入LPS使其终浓度为10ng/ml，4h后取上清液测定IL-6和IL-10表达变化。

第二部分：CLP-19诱导RAW2.7内毒素耐受的分子机制研究

1. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88、TRAF6的mRNA表达变化用50µg/ml CLP-19预处理细胞20h，再用培养基培养2h，向各组中均加入10 ng/ml LPS处理细胞不同时间(0h、1h、3h、6h、12h)后，提取细胞RNA，通过RT-PCR检测细胞因子Toll样受体4 (Toll like receptor, TLR4)、髓样细胞分化因子88(mydoidMyD88，MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)的mRNA变化。以培养基和5ng/ml LPS预处理作为对照。

2. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4的蛋白表达变化

用50µg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，再向各组中加入10ng/ml LPS作用4h后，分别提取胞膜和胞内蛋白，Western Blot检测胞膜和胞内TLR4蛋白的表达变化。以培养基预处理作为对照。

3. CLP-19诱导内毒素耐受后P38的磷酸化水平变化

用50µg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，向各组中均加入10ng/ml

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LPS分别作用不同时间(0min、10min、30min、60min)后，提取细胞总蛋白，Western Blot检测促原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中P38的磷酸化水平。以培养基和5ng/ml LPS预处理作为对照。

4. CLP-19诱导内毒素耐受后Iκ-B的蛋白表达变化

用50µg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，再向各组中加入10ng/ml LPS作用不同时间(0min、5min、15min、30min、60min)后，提取细胞总蛋白，Western Blot检测核因子κB抑制蛋白(I-kappa-B，IκB)的蛋白表达变化。以培养基预处理作为对照。

结果：

第一部分：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究

5ng/ml LPS预处理RAW2.7细胞20h为LPS诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。50µg/ml CLP-19预处理RAW2.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。50µg/ml CLP-19预处理巨噬细胞20h后，炎症因子IL-6表达下调，抗炎因子IL-10表达增加，与培养基预处理组相比，均有显著差异(P<0.01)。

第二部分：CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的分子机制研究

1. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88和TRAF6的mRNA表达变化 RT-PCR结果显示，与培养基预处理细胞组比较，CLP-19预处理细胞组中，随着刺激时间的延长，TLR4 mRNA表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)。而MyD88和TRAF6的mRNA表达均无明显变化(P﹥0.05)。

2. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4蛋白表达降低

Western Blot结果显示，与培养基预处理组相比，CLP-19诱导的内毒素耐受组中，胞膜和胞内TLR4的蛋白表达均下调，有显著差异(P<0.05)。

3. CLP-19诱导内毒素耐受后MAPK通路中P38的磷酸化被抑制

Western Blot结果显示，培养基预处理细胞组中，P38的磷酸化水平在刺激15min后明显增加，30min后达到高峰。与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的耐受组中，P38的磷酸化水平均被显著抑制(P<0.01)。

4. CLP-19诱导内毒素耐受后IκB未被降解

Western Blot结果显示，培养基预处理细胞组中，IκBα在大剂量LPS刺激30min内迅速降解，IκBβ在大剂量LPS刺激60min后迅速降解。与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的耐受组中，IκBα和IκBβ表达水平有显著差异(P<0.01)。

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结论：

1. 50µg/ml CLP-19预处理RAW2.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。

2. 鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过降低TLR4在胞膜和胞内的表达诱导内毒素耐受。

3. 鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过抑制P38磷酸化诱导内毒素耐受。 4. 鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可抑制IκBα和IκBβ的降解，从而抑制NF-κB转位进入胞核，进而诱导内毒素耐受。

关键词：鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19；内毒素耐受；内毒素；脓毒症；单核

巨噬细胞RAW2.7；肿瘤坏死因子α

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鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19诱导RAW2.7

细胞内毒素耐受的实验研究

第一章前言

脓毒症(Sepsis)是一种临床上常见的危重病症，因脓毒症而引起的多脏器功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是导致 ICU (Intensive care unit)病人死亡的主要原因之[1]。作为革兰氏阴性菌细胞外膜主要成分之一的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，也称内毒素(endotoxin)，是脓毒症发生的主要致病因子，因此，从源头上阻止脓毒症的发生，即封闭 LPS 触发的炎症瀑布反应是对抗脓毒症的有效手段之一。

细菌内毒素触发的炎症瀑布反应，是全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或临床上感染性休克的常见原因。同时，小剂量的内毒素也能引起生物体的内毒素耐受现象。内毒素耐受是指体外培养的或动物体内的单核/巨噬细胞等在给予小剂量的内毒素预处理后，对大剂量LPS再次刺激时无反应或反应性明显降低的现象，表现为炎症因子分泌减少，机体炎症损伤减轻，提高动物在致死剂量内毒素再次刺激后的存活率。内毒素耐受是生物在长期进化中形成的一种保护性调节机制，是机体防御机制的重要组成部分。机体通过内毒素耐受减少因内毒素刺激过度反应而造成的病理损伤。但由于内毒素也为导致炎症的关键物质，若通过小剂量给予内毒素诱导内毒素耐受，从而预防潜在的脓毒症的方法具有极大的危险性[2]，因此，寻找一种可诱导内毒素耐受同时又不产生炎性反应的药物是抗感染药学的新策略。

存在于海洋生物鲎的变形细胞中的美洲鲎抗内毒素因子 (Limulus Anti-Lipopolysaccharide Factor, LALF)因其显著的抗菌及中和LPS活性受到广泛的研究，但不论是全基因或功能区重组的表达产物，均具有明显的抗原性或溶血毒性，因此对其进行结构改造已成为脓毒症治疗药物研发的重要目标[3-4]。我们在前期工作中采用生物信息学的手段对LALF功能区结构进行了计算机模拟，以最小活性结构RLWKW为起点向两端突变、修饰，得到多条鲎抗内毒素因子模拟多肽序列(见专利CN200510057195.4)。经Fmoc固相化学合成和初步的中和LPS活性考察，筛选获得一条具有较理想LPS中和及抗菌活性的末端酰胺化和首尾环化的环肽，并将其命名为CLP-19。CLP-19的安全性研究结果表明，其无溶血性、且对巨噬细胞等无致炎作用，

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小鼠急性毒性LD50而为114mg/kg，其安全性良好[5]。

课题组的前期研究结果表明，环状鲎肽(Cyclic Limulus peptide, CLP-19)具有直接中和内毒素的作用，并能显著提高内毒素休克小鼠模型和急性腹膜炎小鼠的生存率[3]。在致死剂量内毒素休克小鼠模型中，感染前20h预防性给予CLP-19表现出很好的保护活性，有效减少血清肿瘤坏死因子α (Tumour Necrosis Factor ,TNF-α)；另在致死剂量大肠埃希氏菌攻击建立的Balb/c小鼠急性腹膜炎模型中，感染前20h预防性给予CLP-19，能显著减少体内的细菌量，提高模型鼠生存率；由于机体的代谢作用，CLP-19提前给予时间越长其在体内的浓度越低，然而提前20h给予CLP-19组脓毒症小鼠的生存率优于提前10h或5h给予CLP-19保护的生存率；提示CLP-19可能具有诱导内毒素耐受作用。

内毒素能够诱导单核巨噬细胞对内毒素本身的不反应状态，即内毒素耐受，CLP-19是否在细胞水平可诱导这种不反应状态呢？课题组选择将RAW2.7细胞以CLP-19预刺激30 min后，再用LPS进行刺激。结果发现，与小剂量LPS刺激内毒素耐受相比，CLP-19预处理组同样可显著降低LPS刺激所引起的炎症因子TNF-α的升高。该现象说明，CLP-19在细胞水平可诱导内毒素耐受，然而其机制有待深入研究。

通过流式细胞仪研究发现，以罗丹明标记的CLP-19在有无血清下均可与小鼠腹脏巨噬细胞株RAW2.7结合，而通过激光共聚焦观察进一步发现，CLP-19主要结合于细胞膜；且以10~40uM的CLP-19单独刺激RAW2.7反应，CLP-19可明显提高单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、及胞间黏附因子细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的mRNA水平及蛋白水平；MCP-1具有趋化炎症细胞、放大炎症信号的作用。而中性粒细胞穿过内皮细胞后迁移至炎症部位是一个多重性过程，需要不同的细胞粘附分子的上调参与。有研究表明，人Cathelicidin家族抗菌肽LL-37也具有类似作用，在体外可上调MCP-1的表达[6]；而天然防御调节因子1(Innate defense regulator，IDR)也可增加感染部位巨噬细胞数量

[7]

；Anastasia研究指出：抗菌肽适度诱导趋化因子在其抗感染起着重要作用[8]。CLP-19

可与单核细胞膜结合，且结合后可上调趋化因子、粘附因子mRNA水平，提示CLP-19可与巨噬细胞相作用，并调节有关炎症因子、细胞因子的表达，并改变细胞对后续刺激的反应性，介导形成内毒素耐受，从而增强机体对炎症和病原微生物的抵抗能力，提高脓毒症模型小鼠的生存率。

综上，来源于鲎抗内毒素因子的模拟肽CLP-19除了可直接中和LPS，还可诱导“内毒素耐受”。因此，本课题拟开展两部分研究，第一部分在细胞水平建立内毒素耐

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受模型，明确内毒素耐受的最佳时间和剂量。第二部分是在内毒素耐受情况下，利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、免疫印迹法(Western Blotting, WB)比较研究巨噬细胞Toll样受体4 (Toll like receptor, TLR4)信号通路相关蛋白mRNA及蛋白的表达变化，初步探讨内毒素耐受的分子机制，通过以上研究，拟明确CLP-19诱导小鼠“内毒素耐受”的作用及其途径，并为其用于脓毒症预防提供理论依据。

论文包括以下两个章节：

第一章：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究第二章：CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的分子机制研究

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第二章 CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的

时间效应和剂量效应研究

内毒素(Endotoxin)又名脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS) ,是革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)细胞壁上的主要成分之一。在机体内LPS主要通过Toll样受体4 (TLR4) 掀起强大的免疫反应[9]，这种免疫反应是被严格的的，但也会失去控制而激发瀑布式的炎症反应，是全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response 同时LPS内毒素还引起生物syndrome, SIRS)或临床上感染性休克的常见原因之一[10]。

体耐受现象[11]。内毒素耐受是指体外培养的或动物体内的单核/巨噬细胞等在给予小剂量的内毒素预处理后，对大剂量LPS再次刺激时无反应或反应性明显降低的现象，表现为炎症因子分泌减少，机体炎症损伤减轻，提高动物在致死剂量内毒素再次刺激后的存活率。内毒素耐受是生物在长期进化中形成的一种保护性调节机制，是机体防御机制的重要组成部分。机体通过内毒素耐受减少因内毒素刺激过度反应而造成的病理损伤。

课题组前期研究中已经明确CLP-19具有诱导内毒素耐受的作用，但CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量并不确定，故本研究通过不同剂量的CLP-19预处理巨噬细胞不同时间后，再给予大剂量内毒素作用于细胞，建立内毒素耐受模型，ELISA检测血清肿瘤坏死因子-α(Tumour Necrosis Factor, TNF-α)、白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)和白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)的表达量，从而确定CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。

2.1 材料与试剂

2.1.1 主要试剂和仪器

鲎抗内毒素因子模拟肽 CLP-19

深圳翰宇生物工程有限公司合成，纯度98.5%，含19个氨基酸，分子量为2511.1

LPS O111:B4

小鼠TNF-α ELISA试剂盒小鼠IL-10 ELISA试剂盒无热原磷酸缓冲液(PBS)

美国Sigma 公司美国R&D System 公司美国R&D System 公司

按照无菌技术称取磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水100ml，用0.1M氢氧化钠调pH为7.0，再经滤器过滤除热原。

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DMSO 胎牛血清胰酶超净工作台 CO2培养箱电子天平

96孔、24孔细胞培养板电热恒温水浴箱倒置显微镜微量天平

2.1.2 实验用品去热原处理

美国Sigma公司美国GIBCO公司美国GIBCO公司苏净集团安泰公司美国Forma Scientific公司

酶标仪 TECAN公司

精天天平仪器厂美国Costar产品上海医疗器械七厂

日本奥林巴斯公司，CKX41-32PH型德国Sartorious公司，BP211D型

EP管、加样器吸头等塑料用品清洗干净后送第三军医大学辐照中心经℃烘烤3h，冷却后备用。其他无菌用品常规高压蒸汽消毒灭菌。

Co辐照

(1×106Gray，48小时)去热原。试管、烧杯、细胞培养瓶等玻璃用品清洗干净后用300

2.2 实验方法

2.2.1 小鼠巨噬细胞TNF-α标准品标准曲线的制备 2.2.1.1 标准品的配制

将标准品和标准通用稀释液从4℃冰箱取出，室温放置20min。向冻干标准品中加入1ml标准通用稀释液，静置15min,待其充分溶解后，轻轻摇匀(浓度为7000pg/ml),然后根据下列浓度进行稀释(700、350、175、87.5、43.8、21.9、10.9、0 pg/ml)。

2.2.1.2. 浓缩洗涤液的配制

将浓缩洗涤液从4℃冰箱取出，室温放置20min，按本次试验所需用量，将浓缩洗涤液用双蒸水以1:20的比例稀释至需要量，使用后未用完的放入4℃冰箱保存。

2.2.1.3. 生物素化抗体工作液的配制

将浓缩生物化素抗体和生物素化抗体稀释液从4℃冰箱取出，室温放置20min，按本次试验所需用量，使用前20min用生物素化抗体稀释液按1:30的比例稀释浓缩生物素化抗体至需要量。

2.2.1.4 酶结合工作液的配制

将浓缩酶结合物和酶结合稀释液从4℃冰箱取出，室温放置20min，按本次试验

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所需用量，使用前20min用酶结合稀释液以1:30的比例稀释浓缩酶结合物至需要量。

2.2.1.5 ELISA法实验步骤

采用ELISA双抗体夹心法，方法按试剂盒说明书进行。操作步骤如下:

1) 取出所需的酶标板条和实验试剂，恢复至室温，每孔中添加检测稀释液RD1-163 50µl

2) 每孔中加入标准品/样品50µl，轻轻拍打板架1min,使其混匀，胶带封口，常温下孵育2h.

3) 吸掉各孔液体，并洗涤5次，每次每孔加400µl洗涤液，每个步骤彻底清除液体，在纸上拍打吸干。

4) 每孔中加入100µl小鼠TNF-α结合物，封上胶带，室温孵育2h. 5) 重复步骤4.

6) 每孔中加入100µl的底物溶液，室温避光孵育30min。加完后立即打开酶标仪预热，设置好程序

7) 每孔加入100µl的终止液，轻轻敲击平板，以使其充分混匀。

8) 用酶标仪检在450nm处读取不同浓度的标准品相应的OD值，绘制标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程。

2.2.2 ELISA法测定LPS诱导内毒素耐受后TNF-α表达量 2.2.2.1.细胞处理及分组：

收集对数生长期RAW2.7细胞，PBS (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。细胞按500µl/孔接种于24孔培养板中，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中孵育过夜，然后每孔分别加入不同浓度(0 µg/ml、0.05µg/ml、0.1 µg/ml、0.2 µg/ml、0.5 µg/ml、1 µg/ml、5 µg/ml、7 µg/ml、10 µg/ml)的LPS作用于细胞，培养不同时间(10h、20h、24h)后，新鲜培养基培养2h，再给予10ng/ml的LPS刺激，4h后取上清液观察不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量，每孔设三复孔。

2.2.2.2 ELISA法测定LPS诱导内毒素耐受后TNF-α表达量 1) 浓缩洗涤液的配制

2) 生物素化抗体工作液的配制

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3) 酶结合工作液的配制

将浓缩酶结合物和酶结合稀释液从4℃冰箱取出，室温放置20min，按本次试验所需用量，使用前20min用酶结合稀释液以1:30的比例稀释浓缩酶结合物至需要量。

4) ELISA法测定LPS诱导内毒素耐受后TNFα的表达量

采用ELISA双抗体夹心法，方法按试剂盒说明书进行。操作步骤如下:

a 取出所需的酶标板条和实验试剂，恢复至室温，每孔中添加检测稀释液RD1-163 50ul

b 每孔中加入标准品/样品50ul，轻轻拍打板架1min,使其混匀，胶带封口，常温下孵育2h.

c 吸掉各孔液体，并洗涤5次，每次每孔加400ul洗涤液，每个步骤彻底清除液体，在纸上拍打吸干。

d 每孔中加入100ul小鼠TNF-α结合物，封上胶带，室温孵育2h. e 重复步骤4.

f 每孔中加入100ul的底物溶液，室温避光孵育30min。加完后立即打开酶标仪预热，设置好程序

g 每孔加入100ul的终止液，轻轻敲击平板，以使其充分混匀。 h 用酶标仪检在450nm处测各孔的OD值(30min内完成)。

按酶标仪上读取不同浓度的样品的OD值，将测得的不同标本的OD值带入直线回归方程中，即得到相应细胞因子TNF-α的含量。

2.2.3 ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后TNF-α表达量 2.2.3.1. 细胞处理及分组

收集对数生长期RAW2.7细胞，磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline, PBS) (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。细胞按500µl/孔接种于24孔培养板中，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中孵育过夜，然后每孔分别加入不同浓度(0 µg/ml、0.1µg/ml、1 µg/ml、5 µg/ml、10µg/ml、20 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml)的CLP-19作用于细胞，培养不同时间(10h、20h、24h)后，新鲜培养基培养2h，再给予10ng/ml的LPS刺激，4h后取上清液做ELISA，测定TNF-α的表达量。以LPS诱导内毒素耐受的最佳时间

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点和剂量点为阳性对照组。每孔设三复孔。

2.2.3.2 ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后TNF-α表达量方法同2.2.2.2 ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后TNF-α表达量 2.2.4 ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后IL-6和IL-10的表达量 2.2.4.1细胞处理及分组

收集对数生长期RAW2.7细胞，磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline, PBS) (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。细胞按500µl/孔接种于24孔培养板中，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中孵育过夜，然后每孔分别加入50 μg/ml的CLP-19，培养20h后，新鲜培养基培养2h，再给予10ng/ml的LPS刺激，4h后取上清液做ELISA，测定IL-6和IL-10的表达量。以LPS诱导内毒素耐受的最佳时间点和剂量点为阳性对照组。每孔设三复孔。

2.2.4.2 ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后IL-6的表达量方法同2.2.2.2 ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后TNF-α表达量

2.2.4.3ELISA法测定CLP-19诱导内毒素耐受后IL-10的表达量 1) 所有使用试剂室温放置20min待用，使用前将所有试剂充分混匀。 2) 样品用样品稀释液以1:1比例稀释后加入50ul于反应孔内。

3) 加入稀释好的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4) 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。

5) 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。 6) 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。

7 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。 8) 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9) 提前30min预热酶标仪，在450nm波长处测定各孔的OD值，根据标准品浓度绘制标准直线。将各样品浓度的OD值带入直线回归方程中，即得到相应细胞因子IL-10的含量。

2.2.5 统计学分析

实验数据以“均值±标准差”(x±s)表示，实验各组值间比较用方差分析，以(P<0.05)

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为显著性差异。

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2.3 结果

2.3.1 LPS诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应的检测

为了探讨LPS诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应，从而确定内毒素耐受的最佳时间和剂量，我们首先通过ELISA方法绘制了标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程(图1-1)，同时检测了LPS以不同剂量用不同时间预处理小鼠单核巨噬细胞RAW2.7后TNF-α的表达量。结果表明，随着LPS刺激时间的延长和刺激剂量的增加，TNF-α的表达量逐渐降低，在5ng/ml LPS预处理细胞20h时，TNF-α表达量最低(图1-2)。因此，我们选择以5ng/ml的LPS预刺激20h作为LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。

图1-1 TNF-α 标准品标准曲线图

图1-2不同时间和不同剂量的LPS预处理RAW2.7细胞对TNF-α 表达水平的影响(n=3)

P<0.01不同预处理浓度与mediu预处理间比较；# P<0.01同浓度的不同预处理时间间比较

TNF Conc, (pg/ml)

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2.3.2 CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应的检测

为了明确CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量，我们通过ELISA方法检测了CLP-19以不同剂量在不同时间预处理小鼠单核巨噬细胞RAW2.7后TNF-α的表达变化。结果表明，随着CLP-19刺激时间的延长和刺激剂量的增加， TNF-α的表达量逐渐降低，特别以50µg/ml的CLP-19预处理20h时，TNF-α表达量最低(P<0.01)(图1-3)。在以50µg/ml的CLP-19预处理20h时，同时检测了炎症因子IL-6和抗炎因子IL-10的表达变化，结果表明，与培养基预处理组相比，IL-10的表达量明显增加(P<0.05)(图1-4)，CLP-19预处理组中IL-6表达量明显减少(P<0.05) (图1-5)。因此，我们选择以50μg/ml的CLP-19预处理细胞20h为CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的最佳时间和剂量。

图1-3 CLP-19预处理RAW2.7细胞诱导内毒素耐受对TNF-α表达水平的影响(n=3)

P<0.01不同预处理浓度与mediu预处理间比较；# P<0.01同浓度的不同预处理时间间比较

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图1-4 CLP-19预处理RAW2.7细胞诱导内毒素耐受对IL-10表达水平的影响(n=3)

P<0.05 不同处理组与medium处理组间比较；*P<0.01不同处理组与blank组间比较

图1-5 LPS或CLP-19预处理RAW2.7细胞对 IL-6表达水平的影响(n=3)

P<0.05 不同处理组与medium处理组间比较；*P<0.01不同处理组与blank组间比较

2.4讨论

课题组前期研究表明，鲎抗内毒素模拟肽CLP-19具有诱导内毒素耐受的作用，然而内毒素耐受的最佳时间和最佳剂量并不确定，故本部分研究首先通过建立内毒素耐受模型，明确CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和最佳剂量，为进一步探讨CLP-19诱导内毒素耐受的分子机制奠定基础。

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内毒素耐受是一个涉及细胞内多条信号转导通路并与多种生物分子相关的较为复杂的网络化过程。其中，TLR4信号途径被认为是诱导内毒素耐受的主要信号途径，该途径主要通过调节相关因子的表达而抑制炎症因子和促进抗炎因子的表达[12]。研究显示[13-14]，与直接给予大剂量内毒素刺激单核细胞/巨噬细胞相比，内毒素耐受最关键的标志是炎症因子的急剧减少，抗炎因子的逐渐增加。大量研究表明，在小鼠巨噬细胞[15-17]和人类单核细胞[14, 18-20]的内毒素耐受中，大多数基因都在LPS再刺激后下调，包括炎症因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子α ( tumor necrosis factor α, TNFα)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-12(interleukin-12, IL-12)、趋化因子配体3(chemokine ligand 3, CCL3)、趋化因子配体4(chemokine ligand 4, CCL4)和人干扰素诱导蛋白10 (Human interferon-inducible protein 10, CXCL10)[21-24]，其中TNF-α下调是内毒素耐受的最重要标志。也有很多基因上调，包括抗炎因子，如白细胞介素-10(Interleukin-10, IL-10), 转化生长因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β) 和 IL-1受体拮抗物(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)等[21-24]。

TNF-α是一种不仅在肿瘤免疫，而且在感染免疫方面都具有显著作用的细胞因子，由多核巨噬细胞产生。TNF-α调节机体的免疫功能，能使某些肿瘤细胞坏死; 另一方面在感染方面的作用受到了广泛关注。TNF-α作为主要的致炎因子，可通过诱导白介素(Interleukin, IL), 干扰素(Interferon, IFN),巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) 等多肽介质的表达[25], 促进炎症的发展。而TNF-α的表达与功能与核转录因子κB (nuclear factor- κB，NF-κB) 有密切关系, 细胞外炎症刺激信号使体内NF-κB活化，增强TNF-α的基因转录, 导致后者的生存和表达的增加；而增加的TNF-α通过正反馈机制再次激活NF-κB，不但使TNF-α的分泌进一步增加, 还可诱导其他促炎细胞因子白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白细胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)的生成和释放，引起级联反应, 导致最初的炎症信号进一步放大[26]。

IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生，它可调节多种细胞的生长与分化，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。IL-6作为重要的炎症介质，主要诱导免疫球蛋白的产生及急性期蛋白的形成，在类风湿关节炎患者滑液中存在高水平的 IL- 6，且其表达水平与疾病活动程度相关[27]。

IL-10是一个主要的抗炎细胞因子，它在过渡表达的炎症反应中发挥了保护宿主和缓和炎症反应的重要作用[28]。研究表明，与单纯LPS刺激单核细胞相比，中和抗

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-IL-10单克隆抗体后导致了更多的细胞炎症因子的生产的，这表明，内源性IL-10的产生抑制了IL-1，IL-6，IL-8，TNF-α的表达[29]。用抗IL-10抗体处理的小鼠对 LPS诱导的休克变得更加敏感[30]。IL-10在内毒素耐受中也发挥了重要的作用。IL-10通过TRAF途径中TRAF3上调是巨噬细胞内毒素耐受的重要标志[31]。此外，研究显示，外周血单核细胞(PBMC)与IL-10的孵育导致了LPS诱导TNF-α的产生受到抑制。LPS预处理巨噬细胞过程中，将IL-10与其抗体中和，能显著减少LPS诱导的内毒素耐受

[32]

。

根据上述研究结论，在内毒素耐受中，TNF-α、IL-6下调和IL-10上调是内毒素

耐受的最重要标志，故本实验以TNF-α、IL-6和IL-10的蛋白表达为评价标准，建立内毒素耐受模型，用ELISA法检测TNF-α、IL-6和IL-10的表达量，确定CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和最佳剂量。实验结果显示，和培养基预处理组相比，CLP-19诱导的内毒素耐受组中，随着CLP-19预处理时间的延长和剂量的增加，TNF-α的表达逐渐减少，当用浓度为50µg/ml CLP-19预处理细胞20h时，TNF-α的表达最低。在TNF-α的表达最低的时间和剂量时，检测了IL-6和IL-10的表达。结果表明，IL-6 表达降低，而IL-10表达增加。通过上述炎症因子和抗炎因子的表达变化，最终确定了CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和最佳剂量。

通过比较LPS和CLP-19诱导的内毒素耐受，CLP-19诱导内毒素耐受后TNF-α的表达量明显比LPS诱导内毒素耐受后高，且有显著差异(p﹤0.05)，由此结论可知，LPS和CLP-19诱导的内毒素耐受在分子机制上可能不同或不完全相同，从而导致了LPS和CLP-19诱导内毒素耐受后TNF-α的表达存在差异。目前研究显示，LPS诱导的内毒素耐受主要通过抑制TLRs致炎途径中相关因子的表达实现的，那么，CLP-19诱导的内毒素耐受是否也通过TLRs途径呢？有待进一步研究。

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第三章 CLP-19诱导RAW2.7细胞内毒素耐受的

分子机制研究

内毒素耐受是机体对过渡诱导的炎症反应的一种适应性调节，是宿主对抗脓毒症休克的一个重要保护机制。该现象已在动物模型和人体的体内和体外实验中被观察到

[13-17, 21-22, 33]

。大量研究表明，Toll样受体家族及其下游信号转导途径是内毒素耐受的

主要途径[12, 34-35]。

Toll样受体(Toll like receptor, TLRs) 是一种模式识别受体( Pattern recognition receptor, PRRs)，能识别微生物进化过程中的一些保守结构即病原相关分子模式( Pathogen-associted molecular patterns, PAMAs)，从而将信号分别通过髓样细胞分化因子88(mydoidMyD88，MyD88)信号通路和MyD88非依赖(小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TNF receptor-associated factor 6，TRAF6))的信号通路向下传递，导致炎症因子和趋化因子的产生[36]。

其中，MyD88信号通路导致了促原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路磷酸化和核转录因子NF-κB与抑制性核因子κB抑制蛋白(I-kappa-B，IκB)分离而活化，从而使转录激活因子蛋1 (Activator protein-1, AP-1)和NF-κB进入胞核，诱导炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12β等的表达[37-39]。而MyD88非依赖途径即TRIF途径引发了干扰素调节因子3 (Interferon regulatory factor 3, IRF3)和信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT1)的激活，从而诱导抗炎因子IL-10和干扰素基因如CCL5和CXCL10等的表达

[12, 16-17, 22]

。

在小鼠巨噬细胞和人类单核细胞诱导内毒素耐受的研究中，内毒素耐受主要与TLR4–MyD88复合物形成减少、白介素-1受体相关激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK-1)活性受损、MAPKs和NF-κB活性缺失等有关[11, 33]，而上述因子的缺陷多数与MyD88依赖的信号级联反应相关。然而，TRIF途径在内毒素耐受中的作用是较为缺乏的[33]。这可能是由于TRIF途径相对来说是一个最近才发现的途径，而且它在炎症中的作用仍然在研究中有关。

课题组前期研究表明，鲎抗内毒素因子模拟多肽CLP-19具有诱导内毒素耐受的作用，且CLP-19在50µg/ml提前20h预处理RAW2.7细胞后，再给予大剂量LPS处理时，能显著降低致炎因子TNF-α的表达，同时升高抗炎因子IL-10的表达。那么

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CLP-19是否也通过作用于TLR4受体和MyD88依赖的信号转导途径诱导内毒素耐受呢？由于CLP-19为本课题组将LALF结构改造后新合成的环状小分子肽，且目前并没有CLP-19诱导内毒素耐受的分子机制的相关研究，故本实验通过建立内毒素耐受模型，以目前研究较为成熟的LPS诱导内毒素耐受为对照，检测TLR4信号转导途径中主要因子TLR4、MyD88、TRIF、MAPKs和IκB的表达变化，初步探讨CLP-19诱导内毒素耐受的机制。

3.1 材料与试剂

主要试剂和仪器

鲎抗内毒素因子模拟肽 CLP-19

LPS O111:B4 抗TLR4抗体抗p-P38抗体抗IκBα抗体抗IκBβ抗体

二抗(HRP标记羊抗鼠抗体) DNA maker DL-2000

PCR引物 Invitrogen Trizol Invitrogen M-MLV反转录酶 Invitrogen DNA Maker 5×蛋白上样缓冲液低分子量蛋白质上样Maker SDS 过硫酸胺 30%丙烯酰胺过硫酸胺 TEMED 1MTris PH6.8

深圳翰宇生物工程有限公司合成，纯度98.5%，含19个氨基酸，分子量为2511.1

美国Sigma 公司

美国Santa Cruz公司(sc-293072) 美国Santa Cruz公司(sc-7973) 美国Santa Cruz公司(sc-3733) 美国Santa Cruz公司(sc-945) 北京中杉科技有限公司大连TaKaRa公司

公司合成公司公司大连TaKaRa公司

上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司

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1MTris PH6.8 10%SDS 30%丙烯酰胺

无热原磷酸缓冲液(PBS)

上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司上海生工生物工程技术服务有限公司按照无菌技术称取磷酸氢二钾8.17g，磷酸二氢钾0.87g，加入蒸馏水100ml，用0.1M氢氧化钠调pH为7.0，再经滤器过滤除热原。

DMSO 胎牛血清胰酶超净工作台 CO2培养箱电子天平

96孔、24孔细胞培养板电热恒温水浴箱倒置显微镜微量天平

美国Sigma公司美国GIBCO公司美国GIBCO公司苏净集团安泰公司美国Forma Scientific公司

酶标仪 TECAN公司

精天天平仪器厂美国Costar产品上海医疗器械七厂

日本奥林巴斯公司，CKX41-32PH型德国Sartorious公司，BP211D型

酶标仪 TECAN公司核酸电泳仪 PCR仪

3.1.2 实验用品去热原处理

EP管、加样器吸头等塑料用品清洗干净后送第三军医大学辐照中心经

美国Bio-Rad公司美国Bio-Rad公司

Co辐照

(1×106Gray，48h)去热原。试管、烧杯、细胞培养瓶等玻璃用品清洗干净后用300℃烘烤3h，冷却后备用。其他无菌用品常规高压蒸汽消毒灭菌。

3.2 实验方法

3.2.1 RT-PCR法分析CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88和TRAF6的mRNA表达变化

3.2.1.1. 细胞处理及分组

收集对数生长期RAW2.7细胞，PBS (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的

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DMEM培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。将细胞按500µl/孔接种于24孔培养板上，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养过夜；次日再向各孔中同时分别加入规定浓度CLP-19或LPS或培养基培养，37℃下孵育20h后，培养基培养2h，再向各组中加入10ng/ml LPS或培养基，然后分别在不同时间点用Trizol处理细胞，提取细胞RNA，行RT-PCR检测各细胞因子基因(TLR4、myD88、TRAF6)表达变化；样本均设三复孔。

阳性对照组：细胞培养过夜，给予培养基继续培养20h后，用培养基培养2h，再给予10ng/ml LPS处理细胞，然后分别在在1h、3h、6h、12h用Trizol处理细胞，提取细胞RNA，行RT-PCR检测各细胞因子基因(TLR4、myD88、TRAF6)表达变化。

5 ng/ml LPS组：细胞培养过夜，给予5 ng/ml LPS处理细胞20h后，用培养基培养2h，再给予10ng/ml LPS处理细胞，然后分别在1h、3h、6h、12h用Trizol处理细胞，提取细胞RNA，行RT-PCR检测各细胞因子基因(TLR4、myD88、TRAF6)表达变化。

50µg/ml CLP-19组：细胞培养过夜，给予50µg/ml CLP-19处理细胞20h后，用培养基培养2h，再给予10ng/ml LPS处理细胞，然后分别在1h、3h、6h、12h用Trizol处理细胞，提取细胞RNA，行RT-PCR检测各细胞因子基因(TLR4、myD88、TRAF6)表达变化。

3.2.2 RNA提取和扩增及产物回收 3.2.2.1 RNA提取

1) 向24孔板每孔细胞中加入500µl Trizol，冰上放置5min，头吹打后，将各孔裂解液吸到1.5 ml RNA酶的 EP管中。

2) 将各号样品放入离心机中离心，13000r/min，4℃，15min。

3) 取上清液至1.5ml无RNA酶的EP管中，吸取过程中不要触碰到沉淀(一般将头调至900µl)。

4) 加入氯仿200µl,用力摇晃无RNA酶的离心管3min，室温放置10min。 5) 离心，13000 r/min，4℃，15min。

6) 取上清液至1.5ml无RNA酶的EP管中，吸取过程不要碰到中间层(头调至400ul)。

7) 加异丙醇800µl，轻轻摇匀，室温静置10min。 8) 离心，13000 r/min，4℃，15min。 9) 倒掉上清液，自然干燥20min左右。

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10) 用20ul焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate, DEPC)水溶解RNA。 3.2.2.2 RNA浓度和纯度测定 1) 取5µl样品价DEPC水至1ml。 2) 用水做空白

3) 将样品放到分光光度计比色槽上，紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。每µl中RNA浓度将是OD值的10倍。

3.2.2.3 RNA扩增及产物回收

引物设计：根据Genebank中公布的各基因数据，用引物设计软件premier5.0设计引物如下：

gene β-actin

Forward Primer Reverse Primer Forward Primer Reverse Primer Forward Primer Reverse Primer

Sequence (5'- 3')

TCATGTACGTCAGAAAATGCTGT ACGTCCTCCTTTACTGTTCCA CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC

TGCTGGAGCTGGGACCCAGCATTGAGGAGGATCAGACACACACAACTTCAGTCGATAG TTCATAGTTTGAGCGTTATACCCGAC CAGACTGATCAAGAATTGTAAGGCG

TLR-4

MyD88

TRAF-6 Forward Primer

Reverse Primer

RT 20 µl体系

RNA提取物 5 µl Olig (dT)

2 µl

含0.1%DEPC的三蒸水 6 µl

5×RT-buffer 4 µl dNTP 0.5µl RNase inhibitor

0.5µl

AMV逆转录酶 2U Total 20µl

PCR反应体系如下：

RT反应产物(PCR模板) 1µl(0.5µg) P1引物 0.5µl(50pmol)

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P2引物 0.5µl(50pmol) dNTPs(每个2.5mmol/L) 0.5µl Pfu Taq DNA聚合酶(5U/µl) 0.5µl 10×PCR buffer

2.5µl

ddH2O 19.5µl Total 25µl 调整格式

反转录条件： RNA提取物和逆转录引物，70℃水浴10min，冰上放置10min，然后依次加入各成分。41℃ 1h (反转录反应)；95℃ 5min(反转录酶失活反应)。PCR反应条件： 95℃ 5min(预变性)；94℃ 1min，60℃ 40s，72℃ 3min30s，共30个cycles；72℃ 10min。

PCR反应结束后，取10µl产物上样电泳，将在每个检测基因泳道中均加入β-actin进行电泳。Bio-Rad凝胶成像仪成像，Quantity One软件扫描条带，以同一管中样品(TLR4、myD88、TRAF6)与β-肌动蛋白(β-actin)产物条带积分光密度值之比(样品/β-actin)，得到该样品基因mRNA相对表达水平，实验在细胞水平重复3次。

3.2.3 Western Blot法分析CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜上TLR4的蛋白表达变化

3.2.3.1. 细胞处理及分组

收集对数生长期RAW2.7细胞，PBS (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。将细胞按1ml/孔接种于6孔培养板上，重复6次(即一个6孔板收集一个细胞样品)，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养过夜；次日再向各孔中分别加入50μg/ml的CLP-19、和培养基培养，37℃下孵育20h后，培养基培养2h，再向各组中加入10ng/ml LPS，然后在4h后分别提取细胞内和胞膜总蛋白并保存。样本均设三复孔。

3.2.3.2 Western Blot实验步骤 1) 胞内总蛋白的提取 a 清洗细胞

预冷的PBS清洗细胞5次，尽量慢慢吸干PBS。 b 裂解细胞

向每个孔加入200µl冰预冷的蛋白裂解液(按100:1比例，加入2µl PMSF溶液)处理细胞，冰上缓慢振摇30min，4ºC，13,000rpm，离心10min，收集上清，分装到1.5ml

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EP管中，每管100ul，-20冻存备用。

2) 胞膜总蛋白的提取

a 收集细胞：预冷的PBS洗一遍，用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。

b 细胞破碎：将细胞悬液转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约50下，使其充分破碎。

c 去除细胞核和未破碎的细胞：4℃，700g离心10分钟，小心收集上清液至一新的离心管中。

d 沉淀细胞膜碎片：4℃，14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。 e 收集细胞浆蛋白：吸取上清即为细胞浆蛋白，可-70℃保存备用。

f 抽提膜蛋白：4℃，14000g离心10秒，尽最大努力吸尽上清。加入膜蛋白抽提试剂B 200微升，最高速剧烈Vortex 5秒重悬沉淀，冰浴5-10分钟。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14000g离心5分钟，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。-70℃保存备用。

3) BCA法进行蛋白定量

a 按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液，充分混匀。

b 将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000µg/ml，1000 µg/ml,500 µg/ml,250 µg/ml,125 µg/ml,62.5 µg/ml,31.25 µg/ml,15.625 µg/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

c 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

d 各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。 e 滴加200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S f 停止震荡，在37度孵育样品30min g 在酶标仪中测量562nm时的吸光值。

h 绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。 4) 凝胶的制备

a 组装好制胶玻璃板。

b 在三角烧杯中配制4ml分离胶，根据蛋白质的分子量来确定胶的浓度：

10%分离胶 12%分离胶 ddH2O

1. ml

1.28 ml

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30%丙烯酰胺

1.5mol/L Tris·Cl，pH8.8 10% SDS 10%过硫酸铵 TEMED

1.32 ml 1.00 ml 0.04 ml 0.04 ml 0.002 ml

1.6 ml 1.04 ml 0.04 ml 0.04 ml 0.002 ml

混匀，迅速在模具的两块玻璃板的间隙中倒入凝胶溶液，小心在胶的上面加入纯水, 使胶充分凝固且平整。

c 在三角烧杯中配制2ml 5%积层胶：

ddH2O 1.14ml 30%丙烯酰胺 0.34ml 0.5mol/L Tris(pH 6.8) 10% SDS

0.50ml 0.02ml

10%过硫酸铵 0.01 ml TEMED 0.002 ml

倒去分离胶上层的ddH2O，用滤纸吸干，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，避免气泡产生。

5) 目的蛋白电泳样品的制备

在提取的细胞蛋白中加入等量的2×loading buffer，水浴锅95℃水浴5min，使蛋白充分变性，于室温冷却。

6) 上样

将凝胶板安装至电泳槽中，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子，使孔间凝胶整齐，用电泳缓冲液冲洗各个加样孔。用微量加样器定量吸取经SDS变性蛋白样品，加入各个加样孔中。

7) 电泳

在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，60V约40min，待样品电泳至分离胶界面时，将电压升为80V，电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘。

8) 转印

SDS电泳完成后，小心拆开电泳装置，将胶切角标示后，以适量的转移缓冲液将凝胶在室温平衡15分钟。在半干转印仪中放入胶和PVDF膜，经15 V转印40min。取出PVDF膜放入封闭液中1 h。

9) 显色

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用TTBS缓冲液洗PVDF膜五次，15分钟二次，5分钟三次。加入HRP标记的羊抗鼠抗体(1:1000稀释)，室温孵育1 h。用TTBS缓冲液洗涤膜五次，15分钟二次，5分钟三次。加入ECL显色液观察。

10) 检测结果

用Bio-Rad的Quantity One软件测出各条带的volume值(intensity×mm2)。同时用β-actin作为实验参照。结果以各条带的volume值除以β-actin条带的volume值表示。

3.2.4 Western Blot法分析CLP-19诱导内毒素耐受后P38的磷酸化水平变化 3.2.4.1 细胞处理及分组

收集对数生长期RAW2.7细胞，PBS (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。将细胞按1ml/孔接种于6孔培养板上，重复6次(即一个6孔板收集一个细胞样品)，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养过夜；次日再向各孔中分别加入50μg/ml的CLP-19、5ng/ml的LPS和培养基培养，37℃下孵育20h后，培养基培养2h，再向各组中加入10ng/ml LPS，然后分别在0min、5min、15min、30min、60min后提取细胞总蛋白并保存。样本均设三复孔。

3.2.4.2 Western Blot实验步骤方法同3.2.3.2实验步骤

3.2.5 Western Blot法分析CLP-19诱导内毒素耐受后Ik-B的表达变化 3.2.5.1 细胞处理及分组

收集对数生长期RAW2.7细胞，PBS (pH 7.0)溶液洗涤，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/ml。将细胞按1ml/孔接种于6孔培养板上，重复6次(即一个6孔板收集一个细胞样品)，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养过夜；次日再向各孔中分别加入50μg/ml的CLP-19、5ng/ml的LPS和培养基培养，37℃下孵育20h后，培养基培养2h，再向各组中加入10ng/ml LPS，然后分别在0min、5min、15min、30min、60min后提取细胞总蛋白并保存。样本均设三复孔。

3.2.5.2. Western Blot实验步骤同3.2.3.2 Western Blot实验步骤

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3.3 结果

3.3.1 内毒素耐受的RAW2.7细胞中， CLP-19预处理组TLR4表达

RT-PCR结果显示，培养基预处理细胞组中，TLR4在LPS刺激3-6h时表达适当下调，12h恢复到正常状态，与0h相当。与培养基预处理组相比，LPS预处理细胞组中，TLR4的表达与培养基处理3h相似，且随着刺激时间的延长TLR4表达下调(P<0.01)。CLP-19预处理细胞组中，TLR4的表达比3h略高，随着刺激时间的延长，TLR4表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)，在LPS和CLP-19诱导的耐受组中，MyD88和TRAF6 mRNA表达均无明显变化(P﹥0.05) (图2-1)。

图2-1 CLP-19诱导内毒素耐受后TLR4、MyD88和TRAF6 mRNA表达水平变化

图2-2 CLP-19诱导内毒素耐受后TLR4 mRNA表达水平灰度扫描结果(n=3)

P<0.05 vs.medium; **P<0.01 vs.medium;

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图2-3 Clp-19诱导内毒素耐受后MyD88 mRNA表达水平灰度扫描结果(n=3)

图2-4 Clp-19诱导内毒素耐受后TRAF6 mRNA表达水平灰度扫描结果(n=3)

3.3.2 内毒素耐受的RAW2.7细胞中， CLP-19预处理组胞内和胞膜TLR4表达下调

由实验得知，CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4 mRNA表达下调，那么其蛋白表达是否会发生变化呢？本实验通过建立内毒素素耐受模型后，收集细胞做Western blot，分析CLP-19诱导细胞内毒素耐受后胞内和胞膜上TLR4的蛋白表达变化。结果

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显示，与培养基预处理组相比，CLP-19预处理组中，膜表面和胞内TLR4表达均下调，且有显著差异(P<0.05)(图2-5)。

图2-5 CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4蛋白表达变化

图2-6 Clp-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4蛋白水平灰度扫描结果(n=3)

P<.0.05 vs.medium;

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3.3.3 内毒素耐受的RAW2.7细胞中，CLP-19预处理组P38的磷酸化被抑制 MAPK通路的激活在调节巨噬细胞的相关功能是非常重要的，主要调节各种转录因子的活化和促/抗炎症因子的产生[40]。由于 MAPK的磷酸化和其活性密切相关[41]，因此，我们试图检测巨噬细胞内毒素耐受后是否会影响LPS诱导的MAPK的磷酸化。故本实验通过建立内毒素素耐受模型后，在不同时间点处理细胞，收集细胞内提取物进行Western blotting，检测其磷酸化水平。实验结果显示，在培养基预处理的巨噬细胞中，LPS介导的p38磷酸化水平在10min后显著增加。在LPS刺激30min后达最佳反应状态(图2-7)。LPS和CLP-19预处理的巨噬细胞中，LPS再刺激10min后MAPK的磷酸化显著的被抑制。

图2-7 Clp-19诱导内毒素耐受后P38磷酸化水平灰度扫描结果

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图2-8 Clp-19诱导内毒素耐受后P38磷酸化水平灰度扫描结果(n=3)

P<.0.05 vs medium；**P<.0.01 vs medium

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3.3.4 内毒素耐受的RAW2.7细胞中，LPS和CLP-19处理组Ik-B的蛋白表达增加 NF-κB 是一个多功能的核转录因子,与LPS诱发的炎症反应密切相关。NF-κB转位进入细胞核前, NF-κB与抑制性IκB结合,当细胞受到LPS刺激后，IκB经过磷酸化、泛素化和蛋白酶降解而与NF-κB分离，从而释放NF-κB二聚体。释放的NF-κB转位入胞核与相应DNA区域结合，从而炎症介质的基因表达[25]。因此，我们首先比较了培养基或CLP-19预处理组中IκBα和IκBβ的降解动力学，从而间接证明NF-κB的转位情况。结果显示，培养基预处理的细胞中，在大剂量LPS刺激细胞30min内引起了IκBa的快速讲解，IκBβ在60min分钟内裂解。和培养基预处理组相比，CLP-19预处理的巨噬细胞中，IκBα和IκBβ的降解均被显著抑制(P<.0.01)(图2-9)。

图2-9 Clp-19诱导内毒素耐受后IκB蛋白表达水平变化

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图2-10 Clp-19诱导内毒素耐受后IκBa表达水平灰度扫描结果(n=3)

P<.0.05 vs medium；**P<.0.01 vs medium

图2-11 Clp-19诱导内毒素耐受后IκBβ表达水平灰度扫描结果(n=3)

P<.0.05 vs medium；**P<.0.01 vs medium

3.4 讨论

在研究体外内毒素耐受机制的过程中，单核细胞/巨噬细胞被认为是体外诱导内毒素耐受的主要细胞[14]。虽然体内和体外内毒素耐受现象之间的确切关系并没有被完全确定，但在体外用LPS预处理巨噬细胞仍然可以使细胞对随后的LPS刺激呈不反应状态[15, 21-22],因此，体外研究内毒素耐受的分子机制已经成为当前研究的主要方式。故本实验以小鼠巨噬细胞RAW2.7作为研究对象，初步探讨了CLP-19诱导内毒素耐受的可能机制。

相关研究已表明，内毒素耐受在上游水平抑制了LPS信号转导[42-43]，主要涉及TLR4参与[44-49]，而TLR4信号传导主要通过MyD88和TRAF6 信号分子[50-52]，故我们首先利用了半定量RT-PCR方法来检测它们的变化情况。结果表明，与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的内毒素耐受组中，随着刺激时间的延长， TLR4的mRNA表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)。MyD88和TRAF6的mRNA表达均无明显变化。Oltorak等研究也显示，在小鼠巨噬细胞系RAW 2.7中[44]，LPS介导的TLR4 mRNA表达也下调，而最近报道的人类心肌细胞中[53]，LPS介导的TLR4 mRNA表达是增加的。目前这种不同的原因还不明确，但是可能LPS诱导的物种或细胞反应的特

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异性引起的。

RT-PCR方法检测上述信号分子的mRNA变化后，由于只有TLR4 mRNA水平有较为明显的变化，故我们又利用Western blot检测了胞内和胞膜TLR4的蛋白变化。结果显示，与培养基预处理组相比，CLP-19诱导的内毒素耐受组中，胞膜和胞内TLR4表达均下调(P<.0.05)。本课题组前期研究表明[54]，环状抗菌肽CLP-19通过与微管结合，减少了高尔基体对TLR4从胞内向胞膜的运输，从而抑制了TLR4在小鼠巨噬细胞膜表面的表达。相关研究也表明，内毒素耐受与TLR4在细胞表面表达的下调有关

[55]

。故我们推测，CLP-19可能通过降低胞膜TLR4的表达而诱导内毒素耐受。针对胞

内TLR4表达为何也会减少，有待进一步研究。

MAPK是一组能被多种信号激活的丝/苏氨酸激酶，经双重磷酸化激活后可参与调节细胞的多种生物活性。目前发现MAPK有四个亚族: P38、 ERK、 ERK5和JNK4，它们位于胞浆信号转导通路的末端，活化后通过转位到核内作用于转录因子而调节基因表达，在调节细胞的增殖、分化、转录因子的活化、细胞因子基因表达和产生过程中发挥了重要作用[40]。而MAPK的活性与其磷酸化密切相关[41]。最近的一些报道表明，在小鼠巨噬细胞内毒素耐受后，MAK的活化下调[56-57]。故本实验研究了CLP-19诱导内毒素耐受后MAPK代表亚族p38的磷酸化水平的变化。研究表明，与培养基预处理相比，在CLP-19和LPS诱导内毒素耐受组中，p38的磷酸化水平显著被抑制(P<0.01)。相关研究显示，MyD88对TLR4募集受损可能抑制了IRAK-1的磷酸化和激活，进一步抑制了下游信号如MAPK通路磷酸化[17, 55, 58]，从而诱导内毒素耐受。虽然实验表明，CLP-19仍可抑制MAPK p38的磷酸化，但CLP-19与LPS结构和生物特性等方面的差异，使CLP-19为何能抑制MAP激酶p38的磷酸化有待进一步研究。

核转录因子NF-κB调节着大量炎症因子的表达，包括TNF-α, IL-1b, IL-6 和 COX2，它由Rel 家族的多种蛋白组成，包括 5 个成员: p65， p50，c-rel， relB 和 p52[59]。在细胞未受刺激时，NF-κB以同源或异源二聚体的形式与蛋白抑制剂IκB家族 (IκBα，β，ε)相结合而存在，当细胞第一次受到外界刺激后，NF-κB主要以异p65/p50二聚体的形式离开IκB后转位到细胞核中，与相应的基因启动子结合触发转录，从而诱导炎症因子的产生。而IκB与NF-κB分离后，迅速被IκB激酶( IKK) 磷酸化降解[59]。当细胞产生内毒素耐受时，P50同源二聚体的表达上调，有活性的P65/P50异二聚体被无活性的P50/ P50同二聚体替换，使 IKK不能被活化，IκB会持续与NF-κB结合，从而抑制了NF-κB 转位入核内并基因表达。故本实验通过检测IκB蛋白的表达量来间接证明NF-κB是否被转入核内而诱发炎症反应。实验结果显示，与培养基预处

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理巨噬细胞相比，CLP-19预处理组中，IκBα 和IκBβ蛋白表均达显著被抑制。在内毒素耐受的小鼠巨噬细胞和人单核细胞中，一些研究已经证明 NF-κB 的活性是降低的

[14]

。研究表明，在耐内毒素耐受的小鼠巨噬细胞中，蛋白抑制剂 IκBα 和IκBβ的表

达水平增加和人类单核细胞系中 RelB的过表达已经被认为是内毒素耐受的一种机制

[16, 19]

。结合本实验结果，可能由于IκB蛋白与NF-κB的牢固结合，致使在CLP-19诱

导的内毒素耐受中，NF-κB易位到胞核的数量更低，从而导致内毒素耐受。

鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19为经LALF改构后得到的一条环肽，其在保持LALF相关特性的同时，还具有诱导内毒素耐受的作用，其诱导小鼠巨噬细胞RAW2.7内毒素耐受的机制可能为：通过下调TLR4在胞膜上的表达、降低P38的磷酸化水平和抑制NF-κB转位入胞核，从而降低炎症因子的产生和增加抗炎因子等的表达，最终诱导内毒素耐受。

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全文结论

1. 50µg/ml CLP-19预处理RAW2.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。

2. 鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过降低TLR4在胞内和胞膜的表达诱导内毒素耐受。

研究主要的创新点：

1．本研究中环状鲎抗内毒因子模拟肽CLP-19为自主设计合成，氨基酸序列及分子结构具有完全知识产权。

2．通过目前研究比较明确的内毒素耐受途径，初步阐明CLP-19诱导小鼠巨噬细胞RNW2.7内毒素耐受的分子机制，为进一步明确CLP-19的作用奠定基础。

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文献综述

内毒素耐受研究进展

摘要:微量内毒素预处理先天性免疫细胞导致其对随后内毒素刺激无反应的现象，称为“内毒素耐受”。临床上，内毒素耐受与脓毒症患者中单核细胞或巨噬细胞相关，主要影响免疫抑制和死亡率。目前内毒素耐受的分子机制仍不清楚。本综述从内毒素耐受的临床表现、MyD88与TRIF信号转导通路诱导炎症信号的激活或耐受、NF-κB功能的调节、染色质修饰的作用和小分子RNA在LPS诱导基因重新编程等方面总结内毒素耐受的新发现，以对内毒素耐受有更新认识。

关键词：内毒素耐受；脓毒症；免疫调节

内毒素耐受(Endotoxin tolerance, ET)是指微量内毒素预处理先天性免疫细胞，如单核细胞/巨噬细胞，导致其对随后内毒素刺激无反应的现象。内毒素耐受的最早报道来自1946年的保罗·比森。研究发现，在兔子体内重复注射伤寒疫苗会使育苗引起的发热逐渐减少[1]。这一现象也在小鼠和人类中同样存在。提前给小鼠注射亚致死剂量的内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)可保护其免受致死剂量的LPS的刺激而死亡。给伤寒发热或疟疾中恢复过来的病人重新注射内毒素表现出发热减少[2]。体外内毒素耐受模型证实，用亚致死剂量内毒素处理小鼠巨噬细胞及人单核细胞后，其对LPS刺激不应答[3-5]。更重要的是，内毒素耐受已经在很多疾病中被报道，包括败血症、外伤、手术和胰腺炎等[6-7]。这些研究表明，单核细胞/巨噬细胞是诱导内毒素耐受的主要细胞，内毒素耐受最关键的标志是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α, TNFα)表达量的急剧减少。然而，ET的分子基础仍不清楚[8-9]。因此此篇综述主要根据目前内毒素耐受的研究现状来探讨内毒素耐受的分子机制，并在相应病理条件下分析内毒素耐受的临床意义。

一．内毒素耐受的表现

小鼠巨噬细胞[3, 10-11]和人类单核细胞[2, 12-14]内毒素耐受的大量研究表明，多数基因都在LPS再刺激后下调，包括炎症因子和趋化因子，如TNFα, IL-6, IL-12, IL-1b, CCL3, TGFb，IL-1RA，清CCL4 和 CXCL10 [4-5, 15-16]，上调的基因包括抗炎因子，如 IL-10,

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除C型凝集素受体(scavenging C-type lectin receptors)（如MARCO, CLEC4a 和CD），负性调节因子（如 IRAK-M和各种抗微生物基因) 等[4-5, 15-16]。

功能上，内毒素耐受后单核细胞吞噬功能和杀灭病原体的能力增加，但抗原呈递能力受损。研究表明吞噬能力增加与细胞表面 CD受体表达上调有关，而抗原提呈受损是由于MHC II类分子（egHLA-DRS）和MHC II类分子主要调节者CIITA的表达减少有关[4, 17]。低致炎能力和抗炎因子的表达上调将有助于防止感染性休克的发生，同时吞噬功能增加可提高细菌清除率。相反，抗原呈递受损可能会抑制或改变适应性反应(adaptive response)的进程[18]。研究显示，内毒素耐受的单核细胞/巨噬细胞的许多特征类似于免疫抑制的M2巨噬细胞[4, 19]。M2巨噬细胞能下调炎症因子如IL-12, TNFα，上调了抗炎因子如IL-10，清道夫受体(scavenging receptor)的表达，增强吞噬作用[20]。在由多种微生物引起的小鼠败血症中，M2样的Gr1+CD11b+阳性的髓系抑制细胞增加了IL-10的表达[21]。除了单核细胞/巨噬细胞，内毒素耐受还影响其他的髓样细胞，如树突状细胞（DC）和嗜中性粒细胞。内毒素耐受DC表现出抑制IL-12、TNFα和IL-6的表达，但增强了IL-10的表达和吞噬功能[22-23]。内毒素耐受的中性粒细胞表现出TLR4表达下降，但保留了其促炎因子表型[24]。非免疫细胞如肠道血管内皮细胞，表现出内毒素耐受相关的白细胞活性和粘附性减少[25]。

二．炎症失调导致了内毒素耐受

炎症是一个复杂的病理生理状态，最初是通过先天性免疫细胞对感染或/和组织损伤的应答表现出来的[1, 26]。先天免疫细胞如单核细胞/巨噬细胞通过在其表面上表达的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)如Toll样受体4 (Toll like receptor，TLR4)来识别和响应“危险信号”(如病原体，组织损伤)。通过识别微生物进化过程中的一些保守结构即病原相关分子模式( Pathogen-associted molecular patterns, PAMAs)，从而介导机体固有免疫应答，诱导适应性免疫应答的发生。

炎症最初阶段被称为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其特征为全身炎症反应，细胞因子瀑布式释放和器官衰竭[27]。SIRS由感染导致，包括败血症和非感染性疾病，如创伤、烧伤、手术、胰腺炎和心脏骤停后的复苏 (统称“非感染性SIRS)。相反，SIRS后期出现出免疫功能低下或内毒素耐受。临床上这种状态多与二次感染相关[7, 28]。败血症代表了一个极其复杂的病理疾病，它主要由全身性细菌感染后天然免疫细胞炎症反应失调引起。疾病的复杂性表现为其双相性质。其明显特征为初始有明显的炎症，包括出现瀑布式的炎症反应；后期表现为先天性免疫细胞内毒素耐受的“免疫功能低下” [7, 29-30]。以健康人外周血单核细胞

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体外LPS刺激为对照，来自败血症患者的外周血单核细胞表现出的特征和内毒素耐受相似，如促炎细胞因子的表达急剧下降，抗炎因子表达上调[16-17, 31]。

单核细胞/巨噬细胞从炎症状态到免疫抑制表型转变的分子基础仍不清楚。目前认为，可能由于脓毒症早期阶段过渡的炎症信号诱导细胞去适应内毒素耐受[26]。例如，在脓毒症巨噬细胞中高度表达的COX2是负责PGE2产生的。不断产生的PGE2能够通过负反馈调节抑制COX2的表达，并刺激抗炎化合物如脂氧素的产生[32]。同样，在炎症初期，巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生的透明质酸酶降解透明质酸（Haluronic acid，HA）通过与其受体CD44的作用可下调单核细胞/巨噬细胞的活性和阻止炎症的产生

[33-36]

。HA刺激的巨噬细胞产生TNFα降低，但IL-10的产生增加。HA可刺激金属蛋

白酶 (MMP) 的产生，而MMP可反过来激活抗炎因子 TGFb的产生[26, 36]。

TNFα 和 IFNγ的出现被视为从炎症到抗炎功能改变的关键，这取决于出现的时间和剂量[37]。IFNγ的抗炎作用在胶原性关节炎治疗上已经得到证实[38]，其他抗炎因子，如IL-10，IL-1RA，SLPI和糖皮质激素，在败血症和非感染性SIRS中已被报道，并认为有助于内毒素耐受[2, 7]。然而，内毒素耐受现象不能一概而论，还应基于细胞类型（如全血，单核细胞，外周血单核细胞）、体外刺激（整个细菌与纯化内毒素）和疾病状态（败血症，创伤或非感染性SIRS）等差异的存在[39-40]。

三．内毒素耐受诱导趋化因子受体的改变和免疫细胞的凋亡

在脓毒症诱导的内毒素耐受中，单核细胞趋化因子受体及其配体的调节可能代表一个重要的机制。研究显示，Fractalkine (CX3CL1)受体对单核细胞的迁移、激活和宿主防御细菌起了关键的作用[41-43]。表达CX3CR1的小鼠单核细胞穿过内皮组织，迁移在内毒素耐受的人类单核细胞中，CX3CR1到炎症组织，招募另一些单核细胞亚群[44]。表达下调，这与脓毒症患者（特别是非幸存者）中脓毒症诱导的免疫抑制一样[43]。类似的，在人类单核细胞中，LPS或细菌刺激后，趋化因子受体CCR2和CCR5的下调已经被报道[45-46]。对于另外一些趋化因子受体的下调是否会在内毒素耐受时发生，是否在介导免疫抑制中发挥了重要作用，有待进一步研究。

在败血症和创伤患者中，循环淋巴细胞数量的急剧下降多与其对感染的易感性相关[47]。霍奇基斯小组的尸检研究证明，在败血症患者的脾脏中，CD4+T细胞、B细胞和卵泡DC有广泛的凋亡现象[7, 47-49]。相反，DC活性增加的小鼠增强了对内毒素休克的抵抗和减弱了LPS诱导的免疫抑制[50]。然而，CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞或 NK细胞却没有观察到凋亡。对T细胞或B细胞缺乏小鼠的实验表明，小鼠对内毒素休克的易感性增加[7]。总的来说，这些证据都强调了在调节感染诱导的免疫抑制中

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免疫细胞凋亡的重要性。然而，细胞凋亡作用在内毒素耐受的体外模型中仍有待研究。

四．TLR途径的差异性内毒素耐受的信号机制

TLR4信号途径是宿主免疫细胞检测革兰氏阴性菌及其内毒素的主要分子机制之一[51-54]。TLR4途径采取两条不同的信号传导通路，MyD88 和 TRIF信号途径 [55-57]。MyD88途径导致了核转录因子NF-kB的激活和炎症基因的转录，如TNFA, IL1B, IL6和IL12B（图1）。TRIF途径引发了转录因子IRF3 和 STAT1 的激活，诱导IFNβ和干扰素基因如CCL5和CXCL10的表达[55-58]。

小鼠巨噬细胞和人类单核细胞的内毒素耐受与TLR4–MyD88复合物形成减少、IRAK-1活性受损、MAPKs和NF-kB活性缺失有关[56, 59]。然而上述缺陷多与MyD88依赖的信号级联反应有关，而TRIF途径在内毒素耐受中的作用是完全缺乏的[56]。可能是由于TRIF途径相对来说是一个最近才发现的途径，而且它在炎症中的作用仍然在研究中。最新研究表明，MyD88 和 TRIF途径在时间上是分开的[60]。在MyD88-/-巨噬细胞中观察LPS刺激引起MyD88途径介导早期NF-κB活化。而TRIF途径与转录因子激活的后期阶段相关[58, 60-61]。在LPS反应中，TRIF介导的IRF3可以直接晚期TNFα的表达[60]，而TNFα被认为是内毒素耐受的关键终点因子，所以在内毒素耐受中，这条途径是不可或缺的。内毒素耐受的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中具有一个有功能的TRIF途径。在这些细胞中，产生于TRIF下游的IFNβ是调节内毒素耐受的分支机制之一 [56]。内毒素耐受的其他标志是IL-10的上调，而他的上调被证实是由TRIF途径通过TRAF3和1类干扰素调节的[62-63]（图1）。TRIF途径在内毒素耐受中的作用在下面研究中也得到证实，包括 (a) TRIF和IFNβ的基因敲除小鼠对内毒素休克的抵抗[58, ]；(b) 在肝细胞、MEF和巨噬细胞中，通过 TRIF的聚集诱导内毒素耐受[65-67]；(c) 在巨噬细胞LPS诱导的基因转录中，大部分依赖TRIF途径[68]。

内毒素耐受常常和抗炎因子的过表达有关，如IL-10和TGFβ，这些抗炎因子有利于单核细胞/巨噬细胞的失活和抑制促炎因子的表达[2, 69-70]。然而，TLR途径的负性因子的发现(图1)，IRAK-M，MKP1， FLN29和ST2基因敲出的小鼠对内毒素休克的易感性增加，表明了其在内毒素耐受中的重要作用[71-74]。然而，这些分子的动力特性及其对人类内毒素耐受的相关性调节是不好界定的。

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图1 内毒素耐受中TLR4途径和负反馈调节作用

五．NF-κB在内毒素耐受中的作用

转录因子NF-κB由Rel 家族的多种蛋白组成，包括5个成员：p65、 p50、c-rel、relB和p52，主要调节炎症因子的表达，包括TNFα, IL-1b, IL-6和COX2等。经典的NF-κB信号包括p65/p50 NF-κB异源二聚体，它和蛋白抑制剂IΚB家族 (IκBa，β，ε)相结合调节其活性 (图1) [75]。NF-κB激活后，IκB被磷酸化，经过泛素降解，p65/p50 NF-kB的活性异二聚体转到细胞核，与相应的基因启动子结合触发转录[1, 76]。在内毒素耐受的小鼠巨噬细胞和人单核细胞中，NF-κB的活性因蛋白抑制剂IκBα和 IκBε表达水平的增加而降低[2]，人类单核细胞系中RelB的过表达已经被认为是内毒素耐受的一种重要机制[10, 13]。

NF-κB活化结果因被激活的阶段不同而不存在差异。在炎症发作期， NF-κB的活化与促炎基因的表达相关，如一氧化氮合酶2 (NOS2)；而在炎症消退期与抗炎基因，如TGFB1的表达相关[77]。在早期炎症中，p65/p50 NF-κB 异二聚体引发TNFα和IL-12基因表达，内毒素耐受时，起主导作用的p50/p50 NF-κB同源二聚体抑制这些炎症基因的表达，同时促进TGFβ、IL-10和COX2基因的表达[77]。这些发现表明炎症不同阶段对NF-κB功能的可塑性，使其从炎症状态到抗炎（也许是内毒素耐受）阶段的过程中获得不同的表型。

六．内毒素耐受的染色质修饰和基因重编程

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转录组学研究表明，在内毒素耐受期间单核细胞/巨噬细胞经历了基因重新编程(gene reprogramming)的过程。Foster等人[5]发现在小鼠巨噬细胞中，具有不同的监管和功能特性的两个亚群基因，经过LPS的进一步刺激，炎症基因表现出被抑制（称为耐受基因），而抗炎基因可能上调或保持诱导型（称为非耐受基因）[4]。内毒素耐受时，这两个基因亚群不同行为的机理是通过TLR诱导的染色质修饰的不同形式被发现的[5,

78]

。这些发现提示抑制炎症因子的基因可能对脓毒症休克具有保护作用。

染色质和DNA的表观遗传修饰是一种重要的基因方式。核小体形成染色质

的基本单元，包括一个147 bp的DNA盘绕周围的组蛋白八聚体（每两个H2A，H2B，H3和H4）。组蛋白修饰 (乙酰化，甲基化或辅酶) 影响DNA卷曲或展开的程度，从而调节基因转录[79]。组蛋白乙酰化和去甲基化提高了转录活性，而组蛋白去乙酰化或甲基化导致了基因沉默[79]。在耐受或不耐受的基因启动子区域，LPS可诱导组蛋白甲基化[5]。用LPS再刺激，仅仅抗微生物基因启动子能使组蛋白重新乙酰化，并募集RNA聚合酶II而转录(图2)。另外，抗微生物基因有一个来自LPS刺激的活性组蛋白修饰，这保证了他们对LPS的二次刺激有更强大的反应[5]。人类单核细胞系对内毒素耐受中组蛋白H3K9的甲基化影响RelB基因的表达，高迁移率族蛋白（HMGB1）和组蛋白H1连接TNFa和IL-1β 基因的启动子引起染色质重组（例如：H3K9的去甲基化），从而导致内毒素耐受期间基因的沉默[14]。

然而，有几个问题仍待进一步回答，即在内毒素耐受中，耐受或非耐受基因的表观遗传。内毒素耐受小鼠巨噬细胞的基因芯片数据揭示了一些相关结果[5]。内毒素耐受时，一些炎症基因仍然被诱导，如CCL5，CXCL9和 CCL8，而并不像其他炎症因子那样被抑制。相反，内毒素耐受期间，抗炎细胞因子IL-10和细胞信号负性因子SOCS1 、SOCS3和A20发现下调。此外，研究表明，在IL-6，IL-8，IL-12p40，内毒素耐受时，CXCL1和CXCL2基因的启动子组蛋白修饰涉及信号介质的[80-81]。

沉默或激活染色质的诱导在初次LPS刺激时表现出依赖一个或多个因子的从头合成

[5]

。主要基因产物如BRG1和IκBz，已被证明在LPS反应期间能够在二次反应基因的

启动子调节中重建[80-82]。这些分子在体外内毒素耐受和脓毒症患者白细胞下的鉴定可能会解释表观遗传学差异的机制基础。

七．micorRNA介导的内毒素耐受的调节

小分子RNA (micorRNA)在基因表达中已经成为一个重要的转录机制。microRNA对先天性免疫信号的影响源于炎性刺激的发现，如 LPS、TNFα和IL-1β，这些炎症刺激在巨噬细胞/单核细胞中将诱导特定microRNAs的表达，进而影响TLR4

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和IL-1受体(IL-1R)信号途径[83-87]。戴维·巴尔的摩的研究小组最先证明，在人单核细胞中，LPS处理增强了两个小分子RNA，miR146和miR155的表达[84-85]。miR146由各种炎症刺激诱导，包括IL-1β、TNFα、TLR2和TLR5的配体[83]。miR146通过转录后IRAK-1和TRAF6蛋白来减弱IL-1R或TLR4信号，从而下调炎症[83, 85]。miR155与LPS诱导的内毒素休克有关。LPS和双链RNA通过自分泌和/或旁分泌释放TNFα来诱导mir155[84]。mir155通过直接作用IKKE而抑制TLR4的信号[88] (图2)。同样，mir155敲除小鼠对LPS休克具有高易感性，主要是与TNFα的高表达有关[]。

另一种microRNA，miR125b发现通过作用于TNFα的3'-非翻译区来诱导它的降解[88]。在LPS刺激期间，miR155上调，而miR125b是下调的。作为炎症循环的负反馈物质，LPS刺激的人类单核细胞和中性粒细胞中，作用于NF-κB (p105/p50 NF-κB)转录的miR9上调[90]。LPS耐受的细胞中，多种细胞因子和趋化因子的差异调节对不同的mRNA和蛋白的稳定性有重要贡献，这表明了 microRNAs 在调节炎症和趋化因子上的一个更重要的作用[91]。在内毒素耐受中，小分子RNA的确切作用是在炎症后期，而非早期。即被LPS或内毒素休克上调的microRNAs 如miR155，miR146a 和miR9，在炎症后期有可能充当一个负反馈调节的作用，通过抑制TL4途径来促进内毒素耐受。然而，这些 microRNAs也许可作用于多个水平，如干扰TLR信号分子，调节下游细胞因子的稳定性或正性调节一些负性调节因子。

图2 内毒素耐受的多层次调节

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八．小结

根据上述研究进展，我们发现，内毒素耐受可以被看作是一个引起炎症失调的负反馈反应(如脓毒症) 。其次，内毒素耐受是一个基因重编和免疫调节的典型例子，而非基因表达和功能的全方位下调。在此背景下，“耐受”这个词的使用可能是一个误导。第三，ET的调节是多层次的，涉及受体、信号分子、负性调节因子和转录后的改变，如染色质重塑和microRNA调节。总结这些调节机制是对内毒素耐受进一步理解的分子基础。

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致谢

本课题在导师夏培元教授的悉心指导下顺利完成，三年来导师对我的谆谆教诲、精心指导和亲切关怀一直是我克服困难完成学业和课题研究的重要动力。夏教授严谨求实的治学态度，渊博的知识，开阔的视野以及敏锐的洞察力将使我受益终身！值此课题完成之际，衷心感谢导师在学习、科研、生活上的精心指导和亲切关怀。

衷心感谢西南医院药剂科陈剑鸿副教授、刘耀博士对本课题设计、实验方法指导等以及学习、生活上的关心与帮助。

衷心感谢西南医院药剂科陈勇川教授和西南医院医教部彭霞老师对我求学期间学习、生活上的关心与帮助

衷心感谢课题组孙凤军博士、李迪博士、王强博士、吕军老师在前期研究中的辛勤工作，为本课题的展开奠定了坚实的基础。

特别感谢西南医院药剂科秦孝建老师，熊丽蓉老师在相关实验上给予的指点与帮助。

衷心感谢史惠卿博士、何洪静博士、幸海燕博士等在实验中提供的建议与帮助。感谢我的家人一直以来对我完成学业所作出的无私奉献与支持。最后感谢所有给予指导、帮助和批评的老师和同学们！

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