・１４２・ 实用肝脏病杂志２０１７年３月第２０卷第２期Ｊ Ｐｒａｃ Ｈｅｐａｔｏｌ，Ｍａｒ．２０１７．Ｖｏ１．２０ Ｎｏ．２ ・实验性肝炎・ ＡｃＳＤＫＰ体外抑制脂多糖诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞 促炎功能研究 ；Ｉ： 李兵航，李梦婷，何玲楠，周达，白洁，丁永年，陈源文，范建高 【摘要】目的探讨Ｎ一乙酰一丝氨酰一天门冬酰一赖氨酰一脯氨酸（ＡｃＳＤＫＰ）对小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞促 取小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞体外培养，分为对照组、脂多糖（ＬＩＰＳ）组和ＬＰＳ加不同浓度的 炎功能的影响。方法ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ，【Ｊ、ｌ０ ｎｍｏ儿和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理组。采用荧光定量ＰＣＲ法检测细胞肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一０【、白细 胞素（ＩＬ）一１ ３、１ＩＴ广６和诱导型一氧化氮合成酶（ｉＮＯＳ）ｍＲＮＡ相对水平；使用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室检测ＲＡＷ２６４．７细胞的 趋化能力；采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测细胞ｉＮＯＳ、磷酸化的蛋白激酶复合体抑制物（ｐ—ＩＫＫ）、磷酸化的Ｋ Ｂ抑制蛋白 （ｐ—ＩＫＢ）和磷酸化的Ｐ６５（ｐ—Ｐ６５）蛋白表达水平。结果ＬＰＳ处理组ＴＮＦ—ｏｔ、ＩＬ一１ ｐ和ＩＬ＿６ ｍＲＮＡ水平显著高于 对照组【分别高出（４１±２．１）倍、（１０７３±８０．８）倍和（１７２６±１１０．２）倍，Ｐ＜Ｏ．０１】；ＡｃＳＤＫＰ（１０ ｎｍｏ］］Ｌ和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处 理组ＴＮＦ一０【水平显著低于ＬＰＳ处理组【分别降低１９．０％和３９．３％，Ｐ＜０．０１】；ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ ｎｍｏｌ／Ｌ和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理组ＩＬ一１ Ｂ水平显著低于ＬＰＳ处理组【分别降低２２．０８％、３５．８％和３８．２％，Ｐ＜０．０１】；ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ／Ｌ、 １０ ｎｍｏｌ／Ｌ和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理组ＩＬ一６水平显著低于ＬＰＳ处理组【分别降低１５．８％、３５．７％和４３．３％，Ｐ＜０．０１】；ＬＰＳ处 理组穿过小室的细胞数为（１３６±５．３）个／ＨＰ，显著高于对照组【（６４±５．３）个／ＨＰ，Ｐ＜０．０１】ｊ而ＡｃＳＤＫＰ处理组穿过小 室的细胞数【分别为（１０５±４．８）、（８５．３－－ｉ５．０）和（７３．７±５．６）个／ｌｉＰ】，显著低于ＬＰＳ组【（１３６±５．３）个／ＨＰ，Ｐ＜Ｏ．０５】；ＬＰＳ 处理组ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著高于对照组【分别为（２１±２．５）倍和（５．９±０－４）倍，Ｐ＜０．０１】，而ＡｃＳＤＫＰ处 理组ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ显著低于ＬＰＳ处理组【分别降低３７．８％、２３＿３％和３３．１％，Ｐ＜Ｏ．０５】；在１０ ｎｍｏ１］Ｌ和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ浓 度ＡｃＳＤＫＰ处理组，两种蛋白水平显著低于ＬＰＳ处理组【分别降低２７．Ｏ％和４０．２％，Ｐ＜０．０５】；ＬＰＳ处理组ｐ－ＩＫＫ、 ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ和ｐ－Ｐ６５表达量均显著高于对照组【分别为（２５．９±４．８）倍、（９．５±０．６）倍和（２．１±０．２）倍，Ｐ＜０．０１】，而 ＡｃＳＤＫＰ（１０ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理组三者水平较ＬＰＳ处理组显著下降【分别为４２．５％、１７．８％和２９．７％，Ｐ＜０．０５ ｏ结论ＡｃＳＤＫＰ 可抑制ＬＰＳ诱导的小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞的炎症反应，这～效应可能与阻断ＩＫＫ／Ｉ Ｋ Ｂ／ＮＦ—Ｋ Ｂ通路有关。 【关键词】ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞；Ｎ一乙酰一丝氨酰一天门冬酰一赖氨酰一脯氨酸；炎症因子；ＮＦ—Ｋ Ｂ；体外 ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７２—５０６９．２０１７．０２．００５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＡｃＳＤＫＰ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｆｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ＲＡＷ２６４．７ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ ｆｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｌｉ Ｂｉｎｇｈａｎｇ，Ｌｉ Ｍｅｎｇｔｉｎｇ，Ｈｅ Ｌｉｎｇｎａｎ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｈｕａ Ｈｏｓｐｉｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９２，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ—ａｃｅｔｙｌ－ｓｅｒｙｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ－ｌｙｓｙｌ－ｐｒｏｔｉｎｅ（ＡｃＳＤＫＰ）ｏｎ ｍｏｕｓｅ ＲＡＷ２６４．７ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＲＡＷ２６４．７ ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｆｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ，ｎａｍｅｌｙ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｏｎｌｙ），ｌｉｐ０ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＬＰＳ）ｇｒｏｕｐ（ＬＰＳ ｏｎｌｙ），ａｎｄ ＡｃＳＤＫＰ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ（ＬＰＳ ｐｌｕｓ ＡｃＳＤＫＰ ａｔ １ ｎｍｏｌ／Ｌ，１０ ｎｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ １００ ｎｍｏｌ／Ｌ）．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｏｒ（ＴＮＦ－ｃ￣），ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１１３，ＩＬ一６ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ＲＡＷ２６４．７ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ａｓｓａｙ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉＮＯＳ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＫＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ （ｐ－ＩＫＫ），ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＫＢ（ｐ－ＩＫＢ）ａｎｄ 基金项目：国家自然科学基金项目（编号： ８１２６００８１１８１１７０４１０）；上海市卫生系统优秀青年人才培养计划项目 （编号：ＸＹＱ２０１１０１０） ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｐ６５（ｐ－Ｐ６５）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＴＮＦ一０【．ＩＬ一１Ｂ ａｎｄ ＩＬ一６ ｉｎ ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ（４１±２．１），（１０７３￣８０．８）ａｎｄ 作者单位：２０００９２上海市交通大学医学院附属新华医院消 （１７２６￣１ １０．２）ｆｏｌｄｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）：ｔｈｅ ＴＮＦ一ⅨｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ＡｃＳＤＫＰ （１ ｎｍｏｌ／Ｌ．１０ ｎｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ １００ ｎｍｏ１／Ｌ） ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ８．１％（Ｐ＞０．０５）， 化内科（李兵航，李梦婷，何玲楠，周达，陈源文，范建高）；医科 大学第二附属医院消化内科（白洁，丁永年） 第一作者：李兵航，男，３Ｏ岁，硕士研究生。主要从事脂肪性肝 病与肝纤维化形成机制研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｂｉｎｇｈａｎｇｓｊ１ｉ＠１６３．ｃｏｒｎ 通讯作者：陈源文，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｓｍｕｓ＠２６３．ｎｅｔ １９．０％（Ｐ＜Ｏ．０１）ａｎｄ ３９－３％（Ｐ＜０．０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ，ＩＬ一１ Ｂ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ２０ｌ７年３月第２０卷第２期ＪＰｒａｃ Ｈｅｐａｔｏｌ，Ｍａｒ．２０１７．Ｖｏ１．２０ Ｎ０．２ ・１４３・ ｂｙ ２２．０％，３５．８％ａｎｄ ３８．２％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，（Ｐ＜０．０１），ａｎｄ ＩＬ一６ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １５．８％，３５．７％ａｎｄ ４３＿３％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）；Ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎ ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ（１３６＋５．３）ｍｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ［（６４±５．３），Ｐ＜０．０１］，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ＡｃＳＤＫＰ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ［（１０５－＋４．８）／ＨＰ，（８５．３±５．０）／ＨＰ ａｎｄ （７３．７±５．６）／ＨＰ，Ｐ＜０．０５］ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｌｅｓｓｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ （Ｐ＜Ｏ．０５）；Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｉＮＯＳ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ （２ １±２．５）ａｎｄ （５．９±０．４）ｆｏｌｄｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｉＮＯＳ ｉｎ ＡｃＳＤＫＰ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ３７．８％，２３Ｉ３％ａｎｄ ３３．１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ２７０％ａｎｄ ４０．２％ ．（ Ｐ＜０．０１）ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０ ｎｍｏＹＬ ａｎｄ １００ ｎｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ＡｃＳＤＫＰ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ；Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐ—ＩＫＫ，ｐ— ＩＫＢ ａｎｄ ｐ－Ｐ６５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ（２５．９±４．８），（９．５±０．６）ａｎｄ（２．１±０．２）ｆｏｌｄｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；Ａｆｔｅｒ ＡｃＳＤＫＰ（１０ ｎｍｏｌ／Ｌ）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ４２．５％（ＪＰ＜０．０１），１７．８％（Ｐ＜０．０５）ａｎｄ ２９．７％（Ｐ＜Ｏ．０５），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＬＰＳ ａｌｏｎｅ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＡｃＳＤＫＰ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ａ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏＨ ｔｈｅ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ｉｎ ｍｏｕｓｅ Ｒａｗ２６４．７ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ ｔｈｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＫＫ／ＩＫＢ／ＮＦ—ＫＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ １ ＲＡＷ２６４．７ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；Ｎ—ａｃｅｔｙｌ－ｓｅｒｙｌ—ａｓｐａｒｔｙｌ－ｌｙｓｙｌ—ｐｒ０１ｉｎｅ；Ｉｎｎａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ；Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ；Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤后细 胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）过度沉积在肝 脏的病理』生过程【ｌ１。目前认为，ＥＣＭ主要由慢性炎症 状态下激活的肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ， ＡｃＳＤＫＰ抗肝纤维化的防治提供进一步的基础研究 依据。 １材料与方法 １．１细胞与试剂小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞系购自 ＨＳＣ）产生，而巨噬细胞向肝内趋化、活化和分化或 肝内库普弗细胞激活是慢性肝内炎症、ＨＳＣ激 中国科学院上海细胞库。ＤＭＥＭ高糖培养基、青霉 素一链霉素和胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）购 自Ｇｉｂｃｏ公司；ＬＰＳ和卡托普利（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）购自 Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＡｃＳＤＫＰ购自瑞士Ｂａｃｈｅｍ公 活、炎性细胞因子分泌和ＥＣＭ产生的重要因素 ３】。 如何减少病理状态下肝内巨噬细胞即库普弗细胞 的促炎功能是抑制肝内慢性炎症及ＨＳＣ活化的关 键。Ｎ一乙酰一丝氨酰一天门冬酰一赖氨酰一脯氨 酸（ＡｃＳＤＫＰ）是内源性乙酰化四肽化合物，广泛存 司；实时定量聚合酶链式反应（ＲＴ—ｑＰＣＲ）￣Ｉ物由上 海生工生物工程股份有限公司合成；Ｔｒｉｚｏｌ、逆转录 试剂盒和ＲＴ—ｑＰＣＲ试剂盒均购自Ｔａｋａｒａ公司；抗 在于哺乳动物体液和组织。ＡｃＳＤＫＰ是最早作为造 血系统的一种生理性生长抑制因子被发现凹。随着 研究的不断进展，发现ＡｃＳＤＫＰ具有促进血管新 诱导型一氧化氮合成酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｉｒｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮＯＳ）多克隆抗体购自ＡＢＣＡＭ公司，其 他一抗均购自Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；ＨＲＰ 生、肿瘤细胞增殖、抑制炎症和抗器官纤维化 等广泛的作用 ，其中抑制炎症和抗器官纤维化在 近年来尤其得到重视 。本研究团队前期研究发现， 在四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织ＡｃＳＤＫＰ 标记的山羊抗小鼠和抗兔ＩｇＧ购自江苏碧云天生 物科技研究所。 １．２小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞的培养和ＬＰＳ诱导 ＲＡＷ２６４．７炎症模型的建立取小鼠ＲＡＷ２６４．７巨 噬细胞，培养于含１０％ＦＢＳ、１００ Ｉｕ／ｍｌ青霉素和 １００ ｍｇ／ｍｌ链霉素的ＤＭＥＭ培养基中，在３７℃、５％ 含量显著降低㈣，维持肝内生理水平的ＡｃＳＤＫＰ可 减轻四氯化碳诱导的大鼠肝脏炎症和纤维化反应， 该作用与ＡｃＳＤＫＰ抑制ＨＳＣ的活化和抑制其分泌 促纤维化和炎性细胞因子有关［８１。但是，ＡｃＳＤＫＰ是 否也影响肝脏慢性炎症或能否库普弗细胞仍 未见报道。本研究在小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞系， ＣＯ 培养箱中培养。将１×１０ 个ＲＡＷ２６４．７巨噬细 胞接种于６孔板，过夜贴壁后加入含ＬＰＳ（１ ｇ／ｍ１） 的新的完全培养基，放入培养箱中继续培养３ ｈ， 检测细胞肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ， 应用脂多糖（１ｉｐ０ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）诱导其活化， 观察了ＡｃＳＤＫＰ对其炎症反应的影响，为以后应用 ＴＮＦ）一 、白介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）一６和ＩＬ一１ Ｂ ｍＲＮＡ水平。 ・１４４・ 肝脏病杂志２０１７年３月第２０卷并 ２期 旦 ｏ２， ！． Ｑ ！： ！： ： １．３ ＡｃＳＤＫＰ处理ＬＰＳ诱导的ＲＡＷ２６４．７巨噬细 胞将１ Ｘ １０６个ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞接种于６孔 培养３ ｈ，收集细胞。 １．４细胞炎症因子ｍＲＮＡ测定取上述处理细胞， 板，实验分为对照组、ＬＰＳ组和ＬＰＳ加不同浓度的 ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ几、１０ ｎｍｏｌ／Ｌ和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理 应用Ｔｒｉｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，将ｍＲＮＡ逆转录合 成ｃＤＮＡ，利用ｃＤＮＡ进行ＲＴ—ｑＰＣＲ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ，美国），基因相对水平 组。过夜贴壁后，各组均换成含有１ ｍｏｌ／Ｌ卡托普 利（防止ＡｃＳＤＫＰ被血清血管紧张素转化酶快速降 解）的新的完全培养基，在ＬＰＳ组和ＬＰＳ加 ＡｃＳＤＫＰ处理组均另加入ＬＰＳ（１ ｇ／ｍ１），在ＬＰＳ加 ＡｃＳＤＫＰ处理组再加入相应浓度的ＡｃＳＤＫＰ。继续 以ＲＱ值（２－＾ ｃｒ）表示，以ＧＡＰＤＨ为内参，计算目 的基因ＴＮＦ—Ｏｔ、ＩＬ一１ Ｂ、ＩＬ一６和ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ相 对水平。实验中所用引物序列见表１。 表１ 引物序列以及产物长度 １．５ ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞趋化能力测定按照文献 制物（ｐ－ＩＫＫ，１：１０００）、抗蛋白激酶复合体抑制物 （ＩＫＫ，１：１０００）、抗磷酸化的Ｋ Ｂ抑制蛋白（ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ， １：１０００）、抗Ｋ Ｂ抑制蛋白（Ｉ Ｋ Ｂ，１：１０００）、抗磷酸化 的Ｐ６５（ｐ－Ｐ６５，１：１０００）和抗Ｐ６５（１：１０００）抗体，４℃ 孵育过夜，与ＨＲＰ标记的二抗结合，采用增强化学 发光法（Ｂｉｏ—Ｒｅｄ，美国）显色。应用Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ３．０软 件对目的条带进行灰度分析，以ＧＡＰＤＨ为内参，对 目的蛋白进行标准化测定。上诉各实验均重复三 次，取均值。 １．７统计学分析 应用ＳＰＳＳ ２０．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．， 报道并稍做调整进行【“】。在２４孔板中加入含有１ ｍｏｌ／Ｌ卡托普利的完全培养基６００ ｌ，将 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室（Ｃｏｒｎｉｎｇ，美国）放人对应的孔中，然后 在小室内接种７．５×１０ 个ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞，培 养３ ｈ，弃去小室内的培养基，加入无血清培养基，加 入ＬＰＳ和ＡｃＳＤＫＰ，实验分组如１－３所述，放入培养 箱继续培养２４ ｈ，用４％多聚甲醛固定细胞，用棉签 擦去小室内细胞，经结晶紫染色，拍照、计数Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ３０００Ｂ，德国１。结果以２００倍镜下每孔随机５个 视野平均细胞数表示。 Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）统计软件进行统计处理，计量资料以 （ ）表示，采用单因素方差分析进行显著性检验，多 组比较采用ＬＳＤ检验，组问比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５ 被认为有统计学意义。 ２结果 １．６ ｉＮＯＳ和ＮＦ—Ｋ Ｂ信号通路蛋白表达的检测采 用免疫印迹法，细胞处理同上１－３所述，培养３０ ａｉｒｎ，用含有蛋白酶抑制剂（碧云天）和磷酸酶抑制 剂（Ｒｏｃｈｅ）的ＲＩＰＡ蛋白裂解液，冰上裂解３０ ｍｉｎ， １４０００ ｒ／ｍ，４￣Ｃ离心２０ ｍｉｎ，取上清液，分装后冻存 于一８０℃冰箱。采用ＢＣＡ法（碧云天）测定蛋白浓 度。取等量的蛋白，行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，将蛋白转移 ２．１ ＡｃＳＤＫＰ能有效降低ＬＰＳ诱导的ＲＡＷ２６４．７巨 噬细胞炎症因子ｍＲＮＡ水平ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞 经ＬＰＳ刺激３ ｈ后，ＴＮＦ—ｏ【、ＩＬ一１ Ｂ和ＩＬ一６ ｍＲＮＡ 到ＰＶＤＦ膜，用５％脱脂牛奶室温封闭２ ｈ，分别加 入抗ｉＮＯＳ（１：８００）、抗磷酸化的蛋白激酶复合体抑 水平分别较对照组升高（４０±２．１）、（１０７２±８０．８）和 （１７２５±１１０．２）倍，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）： 戈ＪＨ肝脏 朵忠２（）ｌ７ ｑ－３门第２０毪 ２期Ｊ，ｈ“・Ｈｅ１）ａｔｏ，，Ｍａｌ－．２０１７．Ｖｌｌ１．２０ Ｎｏ．２ ・１４５・ 在给 ＬＰＳ刺激的同时分别加入ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ／Ｌ、ｌ０ ｎｍｏｌ／ｌ 和ｌＯ０ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理，ＴＮＦ一仅水 ２．２ ＡｃＳＤＫＰ能抑制ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞的趋化活 性ＬＰＳ组穿过小室的细胞数为（１３６．０±５．３）个 平较ｌＪｌ，ｓ组分别降低了８．Ｉ％（Ｐ＞Ｏ．０５）、１９．０％ （Ｐ＜Ｏ．０１）不１ｌ ３９．３％（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１，图１Ａ）；ＩＩ 一ｌ １３水平较 ／ＨＰ，显著高于对照组的（６４±５．３）个／ＨＰ（Ｐ＜Ｏ．０１）； ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ ｎｍｏｌ／Ｉ 和ｌ００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处理 Ｉ Ｐｓ组分别降低丫２２．０％、３５．８％和３８．２％，差异均 具有统计学意义（Ｐ＜０．０ｌ，网ｌＢ）；ＩＬ一６水平较ＬＰＳ 组穿透的细胞数分别下降为（１０５ ４－４．８）个／ＨＰ、 （８５．３±５．０）个／ＨＰ和（７３．７±５．６）个／ＨＰ，均显著低 于ＬＰＳ组（Ｐ＜Ｏ．０１，图２）。 组分别降低了ｌ５．８％、３５．７％和４３．３％，差异均具有 统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０ｌ，图１ｃ）。 Ａ ：； ＴＮＦ－ａ Ｂ Ｃ －三０ ≈ ０ ； 曩 三 ‘ Ｚ ｔ 三 ｔ Ｚ 蕾 Ｚ 卫 Ｅ Ｅ Ｅ 『皋１ ｌ各ｆＨｆ￥胞ＴＮＦ—ｏｃ、ＩＬ一１ Ｂ和Ｌ－６ ｍＲＮＡ水平比较 与对照组比， ：Ｐ＜０．０５； ：Ｐ＜０．０１ 一－－．：３．７＇ｙ－； ：ＬＰＳ ＬＰＳ＋Ａｃ１ ０ｎＭ ＬＰＳ４－Ａｃ１ ００ｎＭ ＬＰＳ＋Ａｃ１ ｎＭ 工 厂］ ｒｌ ｎ ｎ 割２ ＡｃＳＤＫＰ抑制小鼠ＲＡＷ２６４．７ １ 噬细胞趋化能力（２００×，罔Ｉｆｌ标 为１００ Ｍ） 与对照纰比，｛：Ｐ＜Ｏ．０５； ：Ｐ＜Ｏ．０Ｉ ２．３ ＡｃＳＩ）ＫＰ对细胞ｉＮＯＳ和ＮＦ—Ｋ Ｂ信号通路的 影响 【 ＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞后ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ和赁ｌ １表达水平较对照组分别升高（２０±２．５） 倍干¨（４．９±０．４）倍，差异均具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）； 给予 ＳＤＫＰ（１ ｎｍｏｌ／Ｉ 、ｌ０ ｎｍｏｌ／Ｌ和１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）处 ｎｍｏｌ／Ｌ浓度处理，其抑制作川不明显；ＬＰＳ组细胞 ｐ－ＩＫＫ、Ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ和ｐ－Ｐ６５表达量分别比对照组增高 （２４．９±４．８）倍、（８．５±０．６）倍和（１．１ ４－０．２）倍，差异均 具有统计学意义（Ｐ＜０．Ｏ１）；加入ｌ０ ｎｍｏｌ／Ｌ ＡｃＳＤＫＰ 处理后．细胞ｐ－ＩＫＫ、Ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ和ｐ－Ｐ６５表达较ＬＰＳ 理后，ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ水平较ＬＰＳ组分别降低了 ３７．８％、２３．３％和３３．１％，差异具有统计学意义 （Ｐ＜Ｏ．０５，冈３ Ａ）；经１０ ｎｍｏｌ／Ｌ和１００ ｍｎｏｌ／Ｌ浓度 处理组下降了４２．５％、ｌ ７．８％和２９．７％，差异均具有统 计学意义（Ｐ＜０．０５）；经１００ ｎｍｏｌ／Ｉ 浓度ＡｃＳＤＫＰ处 理后，细胞ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ和Ｐ—Ｐ６５表达下降了１８．１％和 ４５．７％，差异均具有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）；在ｌ ｎｍｏｌ／［ 浓度处理组．其抑制作用不明 （图３ ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）。 Ａ ＳＤＫ１，处理细胞ｉＮＯＳ蛋白水平降低了２７．０％和 ４０．２％，第肄具有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５，冈３ Ｂ），而经ｌ ・１４６・ ２０１７年３月第２Ｏ卷第２期Ｃ ｐ＿ｌＫＫ ＩＫＫ ｐ４ｘＢ ＩＫＢ ＪＰｒａｃ Ｈｅｐａｔｏｌ，Ｍａｒ．２０１７．Ｖｏ１．２０ 糯 自 镌 酶饕蟛黪 ＧＡＰＤＨ Ｆ 一 图３ ＡｃＳＤＫＰ对小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞ｉＮＯＳ和ＮＦ—Ｋ Ｂ信号通路蛋白表达的影响 Ａ：在ＬＰＳ刺激的同时给予ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎＭ、１０ ｎＭ和１００ ｎＭ）处理细胞ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ水平；Ｂ：在ＬＰＳ刺激的同时给予 ＡｃＳＤＫＰ（１ ｎＭ、１０ ｎＭ和１００ ｎＭ）处理细胞ｉＮＯＳ蛋白水平；ｃ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ｐ－ＩＫＫ／ＩＫＫ、Ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ／Ｉ Ｋ Ｂ和ｐ－Ｐ６５／Ｐ６５蛋白 表达；Ｄ～Ｆ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测结果的条带灰度值定量分析 ＩＫＫ：蛋白激酶复合体抑制物；Ｉ Ｋ Ｂ：磷酸化的．ｃ Ｂ抑制蛋白 与对照组比， ：Ｐ＜Ｏ．０５； ：Ｐ＜０．０１ ３讨论 白一１表达减少可能是巨噬细胞减少的一个原因【８１， 但ＡｃＳＤＫＰ是否可以直接作用于巨噬细胞，抑制其 趋化和活化等促炎表型，目前并未明了。本研究通 过体外实验，直接观察了ＡｃＳＤＫＰ对ＲＡＷ２６４．７巨 噬细胞炎性细胞因子分泌、趋化能力等功能的影 响。结果显示，ＬＰＳ激活的ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞具有 很强的炎性细胞因子分泌和趋化能力，给予 炎症反应在肝纤维化的发生、发展和转归方面 都起着重要的作用，一定程度上的炎症反应是组织 生理性修复所必需的，但过度的炎症反应导致病理 性修复，造成ＥＣＭ过度沉积 。肝内库普弗细胞是 目前认识的肝脏组织中重要的慢性炎症效应细胞， 在各种肝脏损伤的诱因下被激活 ３】，激活的库普弗 细胞一方面招募更多的炎症细胞（包括循环单核巨 噬细胞）游走到损伤部位并活化，另一方面分泌炎 症因子，加重损伤部位的炎症反应。通过阻断单核 巨噬细胞的趋化和炎症因子的分泌来减轻损伤部 位的炎症反应显得尤为重要。 ＡｃＳＤＫＰ后，巨噬细胞ＴＮＦ—ｏ【、ＩＬ一１ Ｂ和ＩＬ一６等炎 性细胞因子ｍＲＮＡ水平下降，细胞趋化能力明显受 到抑制，说明ＡｃＳＤＫＰ可以直接作用于巨噬细胞， 降低其促炎功能，而这也可能是以往研究中观察到 组织中炎症细胞浸润减少的重要机制［１４，ｔ８］。最近， Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ研究团队证实ＡｃＳＤＫＰ可以抑制ＴＮＦ— ＡｃＳＤＫＰ是内源性乙酰化四肽化合物。研究证 实，ＡｃＳＤＫＰ在不同的动物实验模型中具有抗炎和 抗纤维化作用。ＡｃＳＤＫＰ可以抑制高血压动物心脏 和肾脏炎症细胞的浸润，在心肌梗死后心力衰竭动 诱导内皮性白细胞的胞间黏附分子（ＩＣＡＭ）一１表 达，可能解释了ＡｃＳＤＫＰ可以降低巨噬细胞趋化能 力的另一种机制［１９１。 物也有同样的作用 研。ＡｃＳＤＫＰ同样也减少了Ⅱ型 血管紧张素诱导的高血压动物动脉管壁巨噬细胞 浸润的数量 。本研究团队先前也证实ＡｃＳＤＫＰ可 以减少四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝内ＣＤ４５ 炎 ＮＦ—Ｋ Ｂ信号通路激活是重要的炎症反应机制 之一，阻断该通路的激活是探索许多慢性炎症性疾 病临床治疗方法的重要方向『加．２ｌ１。ＬＰＳ可以结合到巨 噬细胞表面的Ｔｏｌｌ样受体（ＴＬＲｓ，主要是ＴＬＲ４），激 活ＩＫＫ，激活的ＩＫＫ使Ｉ—Ｋ Ｂ磷酸化或者降解，游 症细胞数量网，我们认为病变器官单核细胞趋化蛋 实用肝脏病杂志２０１７年３月第２Ｏ卷第２期ＪＰｒａｃＨｅｐ毗・ｌ，Ｍａｒ．２０１７．Ｖｏ１．２０Ｎｏ．２ ・１４７・ 离出的ＮＦ—Ｋ Ｂ进入核内，促进ｉＮＯＳ和炎性细胞 因子如ＴＮＦ—ｏＬ、ＩＬ—ｌ Ｂ和ＩＬ一６等的转录［２２－２Ａ］。本研 究发现ＡｃＳＤＫＰ下调巨噬细胞ＴＮＦ—ｏｔ、ＩＬ一１ Ｂ和 ＩＬ一６表达的同时，也显著减少了ＬＰＳ诱导的巨噬细 ［１１］Ｈａａｓｅ—Ｋｏｈｎ Ｃ，Ｗｏｌｆ Ｓ，Ｈｅｒｗｉｇ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｔｓｔａａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉｌａ ｏｆ Ｂ１６一Ｆ１０ ｍｅｌｎｏｍａ ｃｅｌａｌｓ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓ１００Ａ４ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＲＡＷ２６４．７ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１４，４４６（１）：１４３—１４８． ［１２］Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＨＷ，Ｔａｃｋｅ Ｆ．Ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｉｎｆｌｍｍ Ａｌａｌｅｒｇｙ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ， 胞内ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ及其蛋白表达水平，同时伴随 ｐ－ＩＫＫ、Ｐ—Ｉ Ｋ Ｂ和ｐ－Ｐ６５蛋白水平的显著下调，表 明ＡｃＳＤＫＰ可能通过抑制ＮＦ—Ｋ Ｂ通路来发挥作 用，而这一结果也得到以往文献的支持【 ，２５］。但 ＡｃＳＤＫＰ是直接抑制ＮＦ—Ｋ Ｂ通路还是通过其它信 号通路，比如ＡＭＰ活化蛋白激酶／沉默信息调节因 子（ＳＩＲＴ）一１通路而间接抑制ＮＦ—Ｋ Ｂ通路，还有待 ２０１１，１０（６）：５０９—５３６． ［１３］邵小娟，张艳梅，魏艳玲，等．ＮＡＳＨ患者脂肪组织巨噬细胞计 数的变化．实用肝脏病杂志，２０１３，１６（６）：５０２—５０４． ［１４］Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ ＯＡ，Ｒａｉｊ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｉｆｂｒｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎ—－ａｃｅｔｙｌ——ｓｅｒｙｌ——ａｓｐａｒｔｙｌ——Ｌｙｓｙｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎ ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ—ｓａｌｔ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２００１，３７（２ Ｐｔ ２）：７９４—８００． 于进一步研究。 综上所述，本研究证实ＡｃＳＤＫＰ抑制由ＬＰＳ诱 导的ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞炎症因子分泌，降低ｉＮＯＳ 水平，抑制细胞趋化活性，伴随ＩＫＫ／Ｉ Ｋ Ｂ／ＮＦ—Ｋ Ｂ 通路的抑制。在后续研究中，需要对慢性炎症肝脏 来源的巨噬细胞进行实验，对这一现象加以深入研 究，为ＡｃＳＤＫＰ作为抗肝纤维化药物开发提供进一 步的实验依据。 【参考文献】 ［１１ Ｗｅｌｌｓ ＲＧ Ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｅｒａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎ－ ｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００９，１３６（２）：３８７—３８８． 【２］Ｗｙｎｎ ＴＡ，Ｂａｒｒｏｎ Ｌ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａ－ ｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，２０１０，３０（３）：２４５—２５７． ［３１ Ｌｉｕ Ｃ，Ｔａｏ Ｑ，Ｓｕｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｉｌｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｔｉｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１０，９０（１２）：１８０５—１８１６． 【４］Ｐｒａｄｅｌｌｅｓ Ｐ，Ｆｒｏｂｅｒｔ Ｙ，Ｃｒｅｍｉｎｏｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ （ＡｃＳＤＫＰ）ａｎｄ ｔｈｙｍｏｓｉｎ ｂｅｔａ ４ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９９１，２８９（２）：１７１—１７５． ［５】Ｈｕ Ｐ，Ｌｉ Ｂ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａ１．ＡｃＳＤＫＰ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ— ｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＰＩ３ＫＣＭＡｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１３．８（１１）：ｅ７９３２１． 【６］ Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，Ｋａｔａｇｉｒｉ Ｆ，Ｓａｔｏ Ｆ，ｅｔ ａ１． Ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ Ｎ—・ａｃｅｔｙｌ－ｓｅｒｙｌ—－ａｓｐａｒｔｙｌ—－ｌｙｓｙｌ——ｐｒｏｌｉｎｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｄ ｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｆｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，２０１４，３７（６）：１０７５—１０７９． ［７１ Ｎａｇａｉ Ｔ，Ｋａｎａｓａｋｉ Ｍ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＳＰ，ｅｔ ａ１．Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｓｅｒｙｌ—ａｓｐａｒ ｔｙｌ－ｌｙｓｙｌ——ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｄｉａｂｅｔｅｓ—－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｄｎｅｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｌａ—ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ，２０１４，２０１４： ６９６４７５． 【８】 Ｃｈｅｎ ＹＷ，Ｌｉｕ ＢＷ，Ｚｈａｎｇ ＹＪ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｓａｌ ＡｃＳＤＫＰ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｅｈｌｏｒｉｄｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１０，５３（３）：５２８－５３６． 【９】Ｈｒｅｎａｋ Ｊ，Ｐａｕｌｉｓ Ｌ，Ｓｉｍｋｏ Ｆ．Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｓｅｒｙｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ—ｌｙｓｙｌ—ｐｒｏ— ｌｉｎｅ（Ａｅ—ＳＤＫＰ）：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｒａｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｈｅａｒｔ， ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｂｒａｉｎ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，２０１５，２１（３５）：５１３５－５１４３． ［１０１陈源文，董国芳，徐雷鸣，等．内源性ＡｅＳＤＫＰ及其前体胸腺素 Ｂ ４在四氯化碳致肝纤维化发生早期的变化．胃肠病学和肝病 学杂志．２０１０，１９（１）：６－９． ［１５］Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ ＯＡ，Ｖｕｌｊａｊ Ｎ，ｅｔ ａ１． Ａｎ舀０ｔｅｎｓｉｎ—ｃ０ｎｖｅｎｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ ｎｅｗ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ２００５，１ １２（１６）：２４３６—２４４５． ［１６］Ｒｈａｌｅｂ ＮＥ，Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｙａｎｇ ＸＰ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ—－ｓｅｒｙｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ—・ｌｙｓｙｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ ｏｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｅｕｌｒａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ２－ｋｉｄｎｅｙ，１－ｃｌｉｐ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａ— ｔｉｏｎ，２００１，１０３（２５）：３１３６—３１４１． ［１７］Ｒｈａｌｅｂ ＮＥ，Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｈａｒｄｉｎｇ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ—ａｃｅｔｙｌ—ｓｅｒｙｌ— ｓａｐａｒｔｙｌ－ｌｙｓｙｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ ｏｎ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｒａｔ ｃａｒ— ｄｉａｅ ｆｉｂｒｏｂｌｓａｔｓ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２００１，３７（３）：８２７—８３２． ［１８］Ｌｉｎ ＣＸ，Ｒｈａｌｅｂ ＮＥ，Ｙａｎｇ ＸＰ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｏｒｔｉｃ ｆｉｂｒｏ— ｓｉｓ ｂｙ Ｎ—ａｃｅｔｙｌ—ｓｅｒｙｌ—ａｓｐａｒｔｙｌ—ｌｙｓｙｌ—ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００８，２９５（３）：Ｈ１２５３一ｈ１２６１． ［１９］Ｚｈｕ Ｌ，Ｙａｎｇ ＸＰ，Ｊａｎｉｃ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ａｃ—ＳＤＫＰ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ＴＮＦ—ａｌ— ｐｈａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＣＡＭ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｌａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩｋａｐｐａＢ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＮＦ—ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１６，３１０（９）：Ｈ１１７６—１８３． 【２０］Ｗａｎｇ Ｘ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａ１． Ｏｒｏｘｙｌｏｓｉｄｅ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌａ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔ— ｉｎｇ ＮＦ——ｋａｐｐａＢ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＰＡＲｇａｍｍａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，２０１６，１０６：７０—８１． 【２１］Ｍａ Ｐ，Ｄｉｎｇ ＹＳ，Ｘｕａｎ ＬＬ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ３，４，５一ｔｉｒｍｅｔｈｏｘｙ一４’，５＇－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｔｒａｎｓ－ｓｔｉｌ— ｂｅｎｅ（ＷＬ一０９—５）ｖｉａ ＲＯＳ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ Ａｓｉａｎ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｓ，２０１６，２０：１—１０． 【２２］Ｗａｎｇ Ｊ，Ｚｈｕ Ｒ，Ｓｕｎ Ｄ，ｅｔ ａ１．１ｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｃｕｒｃｕｍ— ｉｎ—ｌｏａｄｅｄ ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｅｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｅｕｒｅｕｍｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＮＦ—ｋａｐｐａ Ｂ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，１ １（３）： ４０３—４１５． ［２３】Ｓｕｎ ＬＤ，Ｗａｎｇ Ｆ，Ｄａｉ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ— ｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌｍａｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５。９５（３）： １５６－１６９． ［２４］何松美，刘霞，吴煜良，等．草苁蓉乙醇提取物对ＮＡＦＬＤ大鼠肝 脏炎性因子表达的影响．实用肝脏病杂志，２０１４，１７（５）： ５１９—５２２． 【２５］Ｗｏｒｏｕ ＭＥ，Ｌｉａｏ ＴＤ，Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｎａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｌ－ ｆｅｅｔ ｏｆ Ｎ—－ａｃｅｔｙｌ—－ｓｅｒｙｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ——ｌｙｓｙｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ ｄａｈｌ ｓａｌｔ—－ｓｅｎｓｉ ｔｉｖｅ ｒａｔｓ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２０１５，６６（４）：８１６—８２２． （收稿：２０１６－１０－０８） （本文编辑：陈从新）
