山药多糖提取制备工艺的研究

金 华 职 业 技 术 学 院

JINHUA COLLEGE TECHNOLOGY

OF

PROFESSION

AND

毕业教学环节成果

（2011 届）

题 目 山药多糖提取制备工艺的研究 学 院 制药与材料工程学院

专 业 生物制药技术 班 级 学 号 *************** 姓 名 指导教师

2011年5月28日

山药多糖提取制备工艺的研究 金华职业技术学院毕业论文

金华职业技术学院毕业教学成果

目 录

摘 要 ..................................................................................................................................... - 2 - 引 言 ..................................................................................................................................... - 3 - 1 仪器与试药 ....................................................................................................................... - 4 - 1.1 仪器 ................................................................................................................................ - 4 -

1.2 试剂 ........................................................................................................................ - 4 - 2.2 样品溶液的制备 .................................................................................................... - 4 - 2.3 标准曲线的制备 .................................................................................................... - 4 - 2.4 山药多糖提取工艺过程 ........................................................................................ - 5 - 2.5 山药水溶性多糖提取工艺的确定 ........................................................................ - 6 - 3 结果与讨论 ....................................................................................................................... - 7 -

3.1 山药多糖提取工艺条件的确定 ............................................................................ - 7 -

3.1.1 料液比对山药多糖提取得率的影响 ......................................................... - 7 - 3.1.2 提取温度对山药多糖提取得率的影响 ..................................................... - 7 - 3.1.3 提取时间对山药多糖提取得率的影响 ..................................................... - 8 - 3.1.4 提取次数对山药多糖提取得率的影响 ..................................................... - 9 - 3.2 山药多糖提取工艺的优化 .................................................................................. - 10 -

3.2.1 正交设计的因素和水平 ........................................................................... - 10 - 3.2.2 试验设计及考察指标 ............................................................................... - 10 - 3.3 醇沉工艺的优化 .................................................................................................. - 12 - 3.4 最优工艺实验验证 .............................................................................................. - 13 - 4 分析与结论 ..................................................................................................................... - 13 - 谢 辞 ................................................................................................................................. - 15 - 参考文献 ............................................................................................................................. - 15 -

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山药多糖提取制备工艺的研究 金华职业技术学院毕业论文

山药多糖提取制备工艺的研究 金华职业技术学院生物制药技术

摘 要：目的：对山药多糖水提醇沉工艺进行研究，得出山药多糖的最佳提取工艺。方法：以山药总多糖为指标，采用分光光度法，单因素考察及正交设计试验法，对料液比、提取温度、提取时间、提取次数进行考察；并对醇沉浓度、醇沉时间和醇沉次数进行考察。结果：水提正交试验结果表明，料液比1:15，温度100℃，时间4h，提取2次为最佳工艺条件。醇沉正交试验表明，醇沉后溶液浓度为80%，时间为12h，醇沉1次。结论：该实验为山药多糖提取工艺的确定提供依据。 关键词：山药多糖、水提醇沉、正交设计试验法

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引 言

山药既是一种珍贵的药用植物，又是一种常见的食物。山药为薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea oppositaThunb.) 的干燥根茎[1]。山药性平,乃补益药中平稳之品。它平和的药性补而不腻,补而不滞,常在临床上收到意想不到的功效。山药是我国传统名方六味地黄汤的主药之一，李时珍在《本草纲目》中将其功用概括为“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎，润皮毛”五个主要方面[2]。现代医学研究表明,山药具有多种生物活性, 其中多糖被认为是主要功效成分。本研究旨在明确其化学成分以及含量，对山药多糖进行提取，以山药总多糖为指标，确定其制备工艺和质量控制方法，可进一步揭示山药的实用价值、利用潜力和经济价值，采用正交试验优化提取工艺，为山药的深入研究打下基础。

山药多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇，常用水作为提取溶剂。多糖水溶液浓缩后，加入95%乙醇，醇沉的醇浓度根据多糖的结构和性质而不同，一般在70%—85%的范围内，静置24h后，分取沉淀，然后进行去小分子杂质、去蛋白质、去色素等处理，水层再进行醇沉，沉淀分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，60℃减压干燥。

植物多糖的提取一般根据多糖的特性，即多糖是极性大分子化合物，易溶于水或酸、碱、盐溶液，而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂，其特点是从不同的材料中进行提取，即相似相溶原理。一般工艺是：原料→水提→离心→醇沉→干燥→粗多糖。这是目前提取多糖最为常用的方法，本文采用水提醇沉的方法进行提取。

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1 仪器与试药 1.1 仪器

旋转蒸发器（RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（SHB III 上海亚荣生化仪器厂）；紫外可见分光光度计(UV-722N 尤尼柯上海仪器有限公司) ；恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器）；定量移液器（上海求精玻璃仪器厂）；万分之一电子天平（日本岛津）；电热恒温干燥箱（202-OAB 天津力泰斯仪器有限公司）；离心沉淀器（800型 上海手术机械厂）。 1.2 试剂

葡萄糖(产地:石家庄和平，批号110401 )、无水乙醇、95%药用乙醇、浓硫酸、苯酚均为分析纯，山药（产地：河南省新乡市，安徽德昌药业饮片有限公司） 2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥置恒重的葡萄糖适量，置于250mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.354mg/mL的葡萄糖标准溶液，备用。 2.2 样品溶液的制备

精密吸取山药饮片10.00g，加入95%乙醇100℃回流提取2次（每次1h，100mL），过滤，滤渣分别以1:15的料液质量体积比（mg:mL），100℃提取4h，过滤。重复提取3次，合并滤液，放至室温离心，除去淀粉沉淀。离心液浓缩至原体积的1/3，加无水乙醇至醇浓度为80%，静置过夜，离心。沉淀烘干后定容于100mL容量瓶，备用。 2.3 标准曲线的制备

总糖含量测定方法以苯酚-硫酸法测定，通过精密吸取葡萄糖标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL置于50mL容量瓶中，加入6%苯酚溶液溶液1.0mL，摇匀，加浓硫酸5.0mL，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀。另取蒸馏水同上操作制得空白溶液，通过波普扫描确定在490nm处测有最大吸收（见图1），测定490nm处吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线见图2。经回归统计，得标准曲线方程A=32.218X+0.0077，r2=0.9949，浓度在0.00708～0.02124mg/mL范围内与吸光值线性关系良好。

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图1 紫外扫描图谱 表1 标准曲线

标准溶液体积mL 溶液浓度mg/mL 吸光度A

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0354 0.109

0.0708 0.256

0.1162 0.378

0.1422 0.473

0.1775 0.559

0.2124 0.702

图2 标准曲线

2.4 山药多糖提取工艺过程

将山药饮片切碎，加无水乙醇浸泡72h（重复1次），过滤，将滤渣挥干乙醇，再用无水乙醇重复浸泡一次，取滤渣，加水20倍量加热、冷却、离心、沉淀（重复提取3次，每次4h）。合并3次离心液进行减压浓缩，提取浓缩液静置过夜，离心除去淀粉沉淀，取上清液浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇含量达80%，静置过夜后离心，透析，

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透析液加95%乙醇至乙醇含量达80%，最后沉淀，沉淀物干燥得山药粗多糖（白色）。工艺流程图见图3:

山药饮片过滤95%乙醇浸泡数日滤渣1过滤无水乙醇浸泡一次滤渣2过滤20陪量水煎煮3次，每次4h滤液浓缩浓缩液1离心静置、过夜淀粉沉淀弃去上清液减压浓缩浓缩液2静置，过夜，离心加无水乙醇至含醇量达80%离心液沉淀物加水溶解溶液透析透析液沉淀加95%乙醇至含醇量达80%沉淀物干燥山药粗多糖图3 山药多糖提取工艺流程图

2.5 山药水溶性多糖提取工艺的确定

选取与山药多糖提取工艺密切相关的4个因素（料液比、提取温度、提取时间和提取次数）做单因素考察，确定山药水溶性多糖的提取工艺。在单因素考察结果的基础上进行L9(34) 正交试验，优化提取工艺。选取醇沉时间、醇沉次数和醇沉浓度3个因素做单因素考察，确定醇沉工艺，进行L9(33 ) 正交试验，对醇沉工艺进行优化。

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3 结果与讨论

3.1 山药多糖提取工艺条件的确定 3.1.1 料液比对山药多糖提取得率的影响

取等量山药饮片8份，提取温度设定100℃，经过4小时提取3次后，对不同的料液比进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的料液比[4-5]。结果见图4。

表2 料液比对山药多糖提取得率的影响

料液比（g/mL） 提取率（%）

1.2234 1.5368 1.75 1.5836 1.3820 1.1122 0.7872 0.6327 1:5

1:10

1:15

1:20

1:25

1:30

1:35

1:40

图4 料液比对山药多糖提取得率的影响

试验结果表明，随着加水量增加，可溶性多糖含量先升高后逐渐降低，在15倍时达到最大值，故加水量选为1：15。 3.1.2 提取温度对山药多糖提取得率的影响

取等量山药饮片8份，每份料液比为1：15，经过4小时提取3次后，对不同的温度进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的提取温度。结果见图5。

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表3 提取温度对山药多糖提取得率的影响

温度（℃） 提取率（%）

30

40

50

60

70

80

90

100

0.0256 0.0176 0.0368 0.0652 0.1855 0.1936 0.3219 0.8798

图5 提取温度对山药多糖提取得率的影响

该试验表明温度因素对山药水溶性多糖的提取有显著影响。随着提取温度的升高，可溶性多糖含量逐渐升高，100℃时达到最大值，故选提取温度为100℃。 3.1.3 提取时间对山药多糖提取得率的影响

取等量山药饮片5份,每份料液比为1：15，分别回流3次，对不同的时间进行提取比较，根据提取效果来确定最佳的提取时间。结果见图6

表4 提取时间对山药多糖提取得率的影响

时间（小时） 提取率（%）

1 0.5131

2 0.6246

3 0.7139

4 0.8453

5 0.7437

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图6 提取时间对山药多糖提取得率的影响

该试验结果表明，山药可溶性多糖含量随着提取时间先升高后降低，在4h达到最大值，故选取提取时间为4h。

3.1.4 提取次数对山药多糖提取得率的影响

取等量山药饮片4份,每份料液比为1：15，温度设定100℃，经过4小时提取，对不同的次数进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的提取次数。结果见图7

表5 提取次数对山药多糖提取得率的影响

提取次数（次） 提取率（%）

1 1.216

2 1.2576

3 1.2582

4 1.2578

图7 提取次数对山药多糖提取得率的影响

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结果可见，随着提取次数增加，山药多糖含量逐渐增加。但2次与3次、4次含量差别不是很大，故从高效提取角度考虑，选取2次为最佳提取次数。 3.2 山药多糖提取工艺的优化 3.2.1 正交设计的因素和水平

为了提高山药多糖的得率, 采用L9(34)正交表,选用料液比、提取温度、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素拟订3个水平[5-6]。见表6。

表6 因素水平表

因素

水平

A/料液比(倍)

1 2 3

3.2.2 试验设计及考察指标

取山药饮片9份，每份10g，95%乙醇100℃回流提取2次（每次1h，100mL），药渣按正交设计方案提取，提取液静置，待至室温离心除去淀粉沉淀，离心液浓缩至原体积的1/3，浓缩液加加无水乙醇至醇浓度为80%。计算多糖得率。结果见表7。

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B/提取温度(℃)

80 90 100

C/提取时间(h)

2 3 4

D/提取次数(次)

1 2 3

10 15 20

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表7 直观分析表

因素

实验号

A/料液比

实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9 均值1 均值2 均值3 极差

1 1 1 2 2 2 3 3 3 0.6 0.700 0.657 0.043

B/提取温度 C/提取时间 D/提取次数

1 2 3 1 2 3 1 2 3 0.9 0.679 0.693 0.044

表8 方差分析表 F0.1-1（2,2）=9，α=0.1

因素 料液比 提取温度 提取时间 提取次数 误差

偏差平方和 0.003 0.003 0.008 0.021 0.04

自由度 2 2 2 2 8

F比 0.343 0.343 0.914 2.400

F临界值 3.110 3.110 3.110 3.110

显著性

1 2 3 2 3 1 3 1 2 0.631 0.691 0.699 0.068

1 2 3 3 1 2 2 3 1 0.633 0.741 0.8 0.108

Y(%) 0.5560 0.7542 0.6818 0.6668 0.6901 0.7445 0.7242 0.5940 0.6523

注：α=0.1 *表示有显著性差异。

根据方差分析可知，提取温度、时间、次数对山药水溶性多糖的提取影响较大。水提部分四个影响因素的主次顺序为提取次数＞提取时间＞提取温度＞料液比，最佳提取工艺为A2B3C3D2，即采用15倍量水于沸水浴中提取2次，每次提取4小时。

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3.3 醇沉工艺的优化

正交设计的因素与水平：根据影响醇沉工艺的因素，选择醇沉时间、醇沉次数、醇沉浓度3个主要因素作为考察因素，每个因素选择3个水平，进行实验，见表9。

表9 醇沉工艺因素水平表L9（33）

水平 1 2 3

因素

A/醇沉时间（h）

6 9 12

B/醇沉次数（次）

1 2 3

C/醇沉浓度（%）

75 80 85

表10 醇沉工艺考察实验设计

因素

实验号

A/醇沉时间

1 2 3 4 5 6 7 8 9 均值1 均值2 均值3 极差

Y

C/醇沉浓度%

1 2 3 2 3 1 3 1 2 0.699 0.828 0.794 0.129

（%） 0.7242 0.02 0.6682 0.8018 0.7653 0.74 0.9488 0.7240 0.7921

B/醇沉次数

1 2 3 1 2 3 1 2 3 0.825 0.793 0.703 0.122

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1 1 1 2 2 2 3 3 3 0.761 0.738 0.822 0.084

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根据极差分析可知，以多糖得率为指标,醇沉时间、醇沉次数以及醇沉浓度对多糖得率影响不大。醇沉部分三个影响因素的主次顺序为醇沉浓度＞醇沉次数＞醇沉时间，最佳提取工艺为A3B1C2。故为节省资源和操作简便，确定醇沉工艺为：醇沉后，溶液浓度为80%，醇沉1次，时间为12h。 3.4 最优工艺实验验证

在得出最优工艺条件下，进行平行实验，以保证实验的准确性。条件：同一批号取两个以上相同的样品，以完全一致的条件（包括温度、湿度、仪器、试剂，以及试验人）进行试验，看其结果的一致性。

最优工艺的平行实验：取同一批次的山药饮片3份。1号实验，把山药切碎，加无水乙醇浸泡72h（重复1次），过滤，将滤渣挥干乙醇，再用无水乙醇重复浸泡一次，取滤渣，加水15倍量加热（100℃）、冷却、离心、沉淀（重复提取2次，每次4h）。合并3次离心液进行减压浓缩，提取浓缩液静置过夜，离心除去淀粉沉淀，取上清液浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇含量达80%，静置过夜后离心，透析，透析液加95%乙醇至乙醇含量达80%，最后沉淀，沉淀物干燥得山药粗多糖（白色）。剩余2、3号实验同上步骤，取得结果见表11。

综述所上：经平行实验测定，在最优工艺条件下，多糖得率为0.9565%。

表11 最优工艺的平行实验

次数 水平 1 2 3 4 分析与结论

由图4可知，随着料液比的增加，山药中多糖的含量先升高后下降，在1：15时达到最大值。由图5可知，山药多糖的含量随着提取温度的升高而逐渐升高，且在100℃时达到最大值。由图6可知，随着提取时间的增加，山药多糖的含量先升高后降低，在4小时达到含量最大值。由图7可知，山药多糖的含量随着提取次数逐渐高，但2次与3次、4次得率差异不大，本着节约能源，提高效益的原则，故提取次数选择2次。 根据单因素考察及L9(34)正交设计结果表明,以水溶性多糖得率为指标，提取温

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A/料液比 1:15 1:15 1:15

B/提取温度（℃） 100 100 100

C/提取时间（小时）

4 4 4

D/提取次数 2 2 2

Y （%） 0.9543 0.9616 0.9535

平均值（%）

0.9565

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度、提取时间和提取次数对多糖得率有一定的影响。影响因素的顺序为提取次数>提取时间>提取温度>料液比，综合多糖得率，确定最佳提取工艺为：100℃加15倍量水提取2次，每次4h。提取液加入无水乙醇至溶液醇浓度为80%，醇沉时间12h，醇沉次数为1次。

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谢 辞

我的论文能够如期完成是在导师悉心的指导下完成的，导师渊博的专业知识，严谨的教学态度，精益求精的工作作风，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标，掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。对此，我谨表示最诚挚的感谢！并衷心地祝愿他身体健康，工作顺利！

另外，我还要感谢杭州萧山平民大药房给了我实习的机会，让我更好的锻炼自己，充实自己的知识。感谢单位带队老师对我的指导与关照，感谢其他同事的照顾与帮助，是他们让我更有自信的去实践，更相信自己。

本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。此外，我要感谢大学所有老师对我三年来的教育和培养。在三年的大学生活中，我不仅学习了大量的理论知识，开阔了视野，学到了很多在实际生活中有用的东西。

最后感谢各位评审老师对我论文的指导！

参考文献

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