实验一、动物培养液的配制及灭菌

实验目的：学会配制人工合成动物培养液（基）；学会过滤灭菌和高压灭菌 要求：掌握配制人工合成动物培养液（基）的要点；掌握过滤灭菌和高压灭菌的要领

器械和药品：玻璃杯，玻璃棒，电子天平，量筒，NaCl, KCl, Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，HCl, NaOH，PH试纸，生理盐水瓶及塞子，DMEM 内容和步骤：

1配制PBS

KH2PO4 NaCl KCl Na2HPO4·12H2O

（g） （g） （g） （g）

1000ml 0.8 ×10 0.02 ×10 0.2×10 0.02 ×10 500 ml 0.8 ×5 0.02 ×5 0.2×5 0.02 ×5 100ml 0.8 ×1 0.02 ×1 0.2×1 0.02 ×1

（1）烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水; （2）准确称量药品，依次放入烧杯;

（3）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解; （4）调节PH值使之约为7.2; （5）定容；

（6）高压灭菌,10磅15分钟； （7） 分装保存。

2 配制100ml DMEM培养基

（1） 烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水; （2）准确称量药品DMEM 1.17g， （3）准确称量药品NaHCO3 0.37g; （4）准确称量药品谷胺酰胺0.003g；

（5）准确称量药品HEPES 0.5958g;依次放入烧杯; （6）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解; （7）调节PH值使之约为7.2; （8） 定容； （9） 过滤灭菌； （10）分装保存。 注意：

（1）准确称量

（2）准确调节PH=7.2 （3）保存备用

（4）勿浪费药品试剂

3 PBS的高压灭菌（略）和DMEM培养基滤器灭菌

（1） 将塑料环放在上盖与下底之间，锁紧。用双层牛皮纸包好高压蒸汽

灭菌。

1

（2） 选一个适当的容器，如锥形瓶﹑试管﹑窄口瓶..等亦高压蒸汽灭菌。 （3） 将需要灭菌的实验器材溶液配置好。

（4） 将无菌的微孔滤膜（一般由厂商用化学药品灭菌，亦可装入微孔滤

膜装置中一起高压蒸汽灭菌）。

（5） 用无菌的尖细镊子夹住，放在无菌的微孔滤膜装置中。

（6） 将无菌的微孔滤膜装置由下底口套在无菌的容器上。用塑料注射筒

吸取要灭菌的溶液。

（7） 注射筒口插入微孔滤膜过滤装置之上盖口。

（8） 挤压注射筒的推管，使溶液流经微孔滤膜流入无菌容器中。

（9） 移去微孔滤膜，将容器口通过酒精灯火焰，盖上盖子标上溶液名称

及日期。

（10） 拆开微孔滤膜装置，将微孔滤膜丢掉（或灭菌后丢弃），其它装置清

洗干净。

培养基的灭菌简介

培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。

1、高压蒸汽灭菌法

把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指针移至1.1～1.2kg/cm时，即121℃时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。灭菌后要趁热取出三角瓶，不可久不放汽，让压力锅自行冷却，这样易将棉塞等闷得太湿，引起后来长霉污染。培养基自然冷却凝固。放置1 d后再使用。

表1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间

容器的体积(ml)

在121℃下最少灭菌时间(min)

2

2

20~50 15 75~150 20 250~500 25 1000 30 1500 35 2000 40

注意：

（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。对蒸馏水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压力也要提高，一般

2

在126℃维持一个小时。另外三角瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100℃时，培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。

（2）消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置24-72h。放置后如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。另外做好的培养基一般应在1-2周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4℃条件下。

表2 饱和蒸汽压力与其对应的温度

饱和蒸汽压力 kg/cm 磅/平方英寸 0.0 0.141 0.281 0.442 0.563 0.703 0.844 0.984 2、过滤除菌

培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中可能会降解。这类物质需要进行过滤灭菌。例如一些生长因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40℃,再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再加入。

除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于0.4μm。过滤灭菌的原理，是溶液通过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。滤膜的吸附作用力也不容忽视，往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置。液量少时可用注射过滤器，它由注射器、滤器(可更换)、持着部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好，最好放在有螺旋盖的玻璃罐中，经高压灭菌，滤器灭菌不应超过121℃。由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用，在液量多时多用几套这种装置(亦可适当重复使用)也能顺利完成液体灭菌操作。在使用前按无菌操作要求将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起，把吸有需要过滤灭菌溶液的注射器插入细菌过滤器与之相配合的插接口，推压注射器活塞杆，将溶液压过滤膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了，但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过。在一般情况下，人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒。更严格的实验研究中，这一点仍不容忽视。毫无疑问，过滤过的溶液要按无菌操作要求尽快加入培养基中，以免重新遭到污染。假如需经过滤灭菌的溶液带有沉淀物，那么在过滤灭菌之前可用3号烧结玻璃滤器预先予以去除，这样可以减少细菌滤膜微孔被堵塞的情况。

3

2

温度 ℃ 100 103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.9

饱和蒸汽压力 kg/cm 磅/平方英寸 1.055 1.125 1.266 1.406 1.543 1.681

15 16 18 20 22 24 30 50

2

温度 ℃ 121.0 122.0 124.1 126.0 127.8 129.6 134.5 147.6

0 2 4 6 8 10 12 14

作业：

1. 灭菌方式的选择分析

2. 为什么进行细胞培养时培养液中需要加入一定量的小牛血清？ 3. 如何确认你所配制的培养基没有被细菌污染？

实验二、动物细胞的组织块培养法

目的：学会动物皮肤取材法；学会动物内脏组织的取材；学会动物组织块培养法 要求：掌握动物皮肤取材的要点

器械，药品和实验动物：剪刀，镊子，载玻片，盖玻片，滴管，大头针，70％乙醇，无水乙醇，脱脂棉，小鼠，碘酒 内容和步骤：

1动物皮肤组织的取材及培养

（1）剪毛

先用剪毛剪剪去长毛，再用手术刀片或人用刮胡刀片将短毛刮净； （2）消毒

先用刮除皮毛的区域把毛屑清理干净，再用碘酒消毒3次，消毒时先内后外，勿有遗漏；再用酒精消毒3次以上。注意人消毒勿用酒精。

（3）用灭菌的手术器械剪取5×5 mm2的皮肤块，若将动物留存，需将伤口缝合。

（4）将剪取5×5 mm2的皮肤块去脂肪组织和结缔组织 （5）将剪取的5×5 mm2的皮肤块用生理盐水或PBS进行漂洗3次，每次5分钟，以减少污染概率；

（6）将剪取的5×5 mm2的皮肤块剪成1×1 mm2的皮肤块 （7）加适量的培养液体浸润组织块，勿使组织块漂浮； （8）将培养瓶翻转180º，加5 ml液体；

（9）将培养瓶放入CO2培养箱，37ºC，饱和湿度培养24h;

（10）将培养瓶翻转180º，继续培养，并观察污染情况。若污染，及时清理出培养箱。

2动物肝脏组织的取材及培养

1剪毛

先用剪毛剪剪去长毛，再用手术刀片或人用刮胡刀片将短毛刮净； 2消毒

先用刮除皮毛的区域把毛屑清理干净，再用碘酒消毒3次，消毒时先内后外，勿有遗漏；再用酒精消毒3次以上。注意人消毒勿用酒精。

3剪开腹部皮肤，肌肉，腹膜，剪取剪取10 mm3的肝脏块。 4将剪取的10 mm3的肝脏块去大的血管；

5将剪取的10 mm3的肝脏块用生理盐水或PBS进行漂洗3次，每次5分钟，除去血液；

6将剪取的10 mm3的肝脏块用眼科剪刀剪碎成剪取1 mm3的皮肤块； 7将剪取1 mm3的肝脏块用消毒的长镊子放入培养皿或培养瓶，组织块的密度以1块/1cm2左右为宜。

8加适量的培养液体浸润组织块，勿使组织块漂浮；

4

9将培养瓶翻转180º，加5 ml液体；

10将培养瓶放入CO2培养箱，37ºC，饱和湿度培养24h;

11将培养瓶翻转180º，继续培养，并观察污染情况。若污染，及时清理出培养箱。

若用整个的肝脏为取材对象，则最好进行肝脏灌流再取材。 作业：

1. 防止污染的因素分析 2. 小快法培养成功的要点

实验三、动物细胞的消化培养法

目的：学会使用最常用的酶消化细胞并进行培养

要求：要求细胞活力70%以上，无菌操作，使细胞能够传代

药品器械：0.25％胰蛋白酶或胶原酶，培养基，酒精，手术器械，血细胞记数板，显微镜，小鼠或鸡，CO2培养箱，滤器，0.04％EDTA钠盐，滤筛，0.4％台盘蓝 内容：

（1）无菌取材 （2）无菌消化

将剪取的10 mm3的肝脏用眼科剪刀剪成1 mm3的肝脏块后，加入充分PBS洗涤，加1ml无菌的胰蛋白酶/ EDTA液进行消化20分钟，并用吸管轻轻吹打，使组织块充分消化。

（3）终止消化

加入含10%血清的DMEM 1 ml终止消化； （4）过滤

用200目的滤筛进行过滤，液体收集到试管中； （5）离心

用离心机在300g-500g条件下离心，去上清；用DMEM 2 ml重新悬浮细胞，离心。重复3次，每次离心5分钟。

（6）细胞记数

将细胞用适量的DMEM悬浮后，用移液吸取0.1 ml稀释至1ml，充分混匀，吸取几滴至血细胞记数板，盖上盖玻片，在显微镜下10×10 条件下进行记数。记数时对周边的4个大格内的细胞进行记数 n，而后用公式

M=n/4×104

进行稀释前的细胞密度计算。

（7）细胞调整

调整细胞密度至2×106个/ ml。 （8）检测细胞活力

取0.36ml细胞悬液，加 0.04 ml 0 .4%的台盘蓝染料，混匀。染色2一3分钟用血细胞记数板对活细胞和死细胞记数。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活性测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

（9）调整活细胞密度至1×106个/ ml。 （10）接种细胞

5

按5×104个/ cm2的密度接种细胞至培养瓶。

（11）将培养瓶放入CO2培养箱，37ºC，饱和湿度培养24 h,以观察污染情况。

作业：1. 细胞活性和分离单细胞数量的影响因素分析

2. 单细胞分离效果的影响因素分析

注：血细胞计数板是特别的厚玻璃片。计分9个大方格，大方格每边长度1mm、深度为0.1mm，细胞计数板的每个大格体积1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm3，计数板四角的大方格适用于血细胞计数。 取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度，认清 计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则

实验四、细胞的超低温冻存,复苏

实验目的：

了解细胞冻存的常用方法和复苏方法，为以后的综合实验奠定基础。

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内环境和外环境中的水都会形成冰晶，从而导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，甚至引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲基亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

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实验器材：

液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机、水浴锅、血球记数板，胚胎程序化冷冻仪、培养皿、一次性注射器。 实验药品：

25％胰酶、10培养基、甘油、二甲基亚砜（DMSO），PBS液、生理盐水，PVP、BSA（牛血清白蛋白）等。 操作步骤：

（一）冻存

1、消化细胞（同上实验），将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10min，弃上清液。用Hanks液清洗1-2次。

3、 淀用配制好的Hanks液+20% 胎牛血清+10%甘油或DSMO的细胞冻 存液稀释，计数，调整至5×106/ml左右。 4、 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、 将冻存管口封严。如用冷冻管封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 6、 贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、 按下列顺序降温：室温→4℃冰箱（30min）→低温冰箱（－30℃－1h）→液氮罐口（30min）→液氮。

注意：冷冻操作和添加液氮时要注意戴保护眼镜和手套，以免液氮伤人，切勿用裸手直接接触液氮，以免冻伤。液氮定期检查，在液氮挥发1/2时要及时补充，绝对不能挥发干净，一般30L的液氮能用1～1.5月。留在液氮罐外的系线要做好标记并做到沿着罐口顺序摆放。 （二）复苏

1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装三分之二37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在

1min之内融化。

3、用酒精棉球消毒冻存管表面，打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中并立即

加入5倍以上的Hanks液。 4、1000rpm离心10min，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10min，弃上清液。

6、加适当培养基调整细胞浓度5×105后将细胞转移至培养瓶中，37℃、5%二氧化碳、饱和湿度下培养，第二天观察生长情况。 作业：

在冷冻过程中为什么要用慢速冷冻的方法，而不采用将细胞放入液氮中的超速冷冻方法?复苏时则相反，为什么？

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