实验：总维生素C的测定—2，4-二硝基苯肼比色法
一、实验目的
1.了解天然维生素C 的结构功能以及天然存在形式。 2.掌握测定总维生素C 的原理与方法。 二、实验原理
总抗坏血酸包括还原型Vc、脱氢型Vc 和二酮古龙糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4 -二硝基苯肼作用生成红色脎。脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，由此通过比色可对样品中总坏血酸进行定量。 三、仪器和试剂
仪器：恒温水浴锅（37±0.5℃）、紫外-可见分光光度计、组织捣碎机。 试剂：本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。
1、4.5mol/L 硫酸：小心将250mL 硫酸(比重1.84)加入到700mL 水中，冷却后用水稀释至1000mL。
2、(9+1)硫酸：小心将900mL 硫酸(比重1.84)加入到100mL 水中，搅拌均匀。 3、2% 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L2，4 -二硝基苯肼溶液)：溶解2g 2，4 - 二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L 硫酸内，过滤使用（不用时存于冰箱内，每次用前过滤）。 4、2%草酸溶液(20g/L草酸溶液)：溶解20g 草酸(H2C2O4)于700mL 水中，再加水
稀释至1000mL。
5、1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)：稀释500mL 2%草酸溶液到1000mL。 6、1%硫脲溶液(10g/L硫脲溶液)：溶解5g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。 7、2%硫脲溶液(20g/L硫脲溶液)：溶解10g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。 8、1mol/L 盐酸：取100mL 盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。
9、抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)：溶解100mg 纯抗坏血酸于100mL 1%草酸中。 10、活性炭：将100g 活性炭加到750mL 1mol/L 盐酸中，水浴回流1-2h，过滤，
3Fe用水洗数次，至滤液中无铁离子（）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。
检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁（20g/L亚铁）与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。 四、操作步骤
（全部实验过程应避光） (一)样品的测定 1.浸提：
鲜样的制备：称100g 鲜样和100g 2%草酸溶液(20g/L草酸溶液)，倒入捣碎机中打成匀浆，取10-40g 匀浆(含1-2mg 抗坏血酸)倒入100mL 容量瓶中，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀释至刻度，混匀。
将浸提液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。
干样制备：称1-4g 干样(含1-2mg 抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀释至刻度，混匀。
将浸提液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。 2.氧化处理：
取25mL 上述滤液，加入2g 活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL 此氧化提取液，加入10mL 2%硫脲溶液(20g/L硫脲溶液)，混匀（得到‘样品氧化液’）。 3.呈色反应：
编号 1 2 3 样品氧化液/ml 4 4 4 2% 2，4 -二硝基苯肼溶液/ml --- 1 1 加盖在37±0.5℃水浴保温3h，3h后取出，除空白管外，所有试管放入冰水中 2% 2，4 -二硝基苯肼溶液/ml 1 --- 1号管在室温中放置10～15min 后放入冰水内 (9+1)硫酸/ml （边加边摇动试管滴加时间至少需要1min） 5 5 5 硫酸滴加完毕，将试管自冰水中取出，在室温准确放置30min 显色 4.比色
用1cm 比色杯，以空白液调零点，于500nm 波长测吸光值。 (二)标准曲线绘制
1、加2g 活性炭于50mL 标准溶液中，摇动1 min，过滤。
2、取10mL 滤液放入500mL 容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀释至刻度（抗坏血酸浓度20μg/mL）。
3、取5，10，20，25，40，50，60稀释液，分别放入7个100mL 容量瓶中，用1%硫脲溶液(10g/L硫脲溶液)稀释至刻度，（最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，
2，4，5，8，10，12 μg/mL）按样品测定步骤形成脎并比色。
4、以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。
XcVmF(1001000)五、计算 式中：
X—样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；
c—由标准曲线查得或回归方程算得‘样品氧化液’中总抗坏血酸的浓度，μV—试样用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)定容的体积，mL； F—样品氧化处理过程中的稀释倍数； m—试样质量，g。
（同一实验室平行或重复测定，相对偏差绝对值≤10%。）
g/mL；
