中国神经免疫学和神经病学杂志２０１７年５月第２４卷第３期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｎｅｕｒｏｌ ２０１ ７，Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．３ ・１８３・ ＳＭＡＤ６在Ａｌ３诱导的神经毒性病变中的表达变化 张莹洁摘要：目的安娜 探讨母抗Ｄｐｐ小同源物６（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇ ６，ＳＭＡＤ６）在８淀 粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ ｐ，ＡＢ）诱导的神经毒性病变中的表达变化。方法 取孕１５～１７ ｄ的ＳＤ大鼠的胎鼠，进行海 马神经元原代培养，经不同浓度（１０、１５、２０ ｍｏｌ／Ｌ）Ａ［￣２５—３５毒性片段处理后，通过定量ＰＣＲ技术检测ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ表达水平。取２月龄ＳＤ雄性大鼠１２只，随机分为Ａ８注射组和空白对照组，每组６只。采用双侧基底 前脑注射Ａ８ｌＩ４０建立大鼠痴呆模型，通过免疫组化及免疫印迹检测基底前脑及海马区ＳＭＡＤ６蛋白表达水平。 结果 不同浓度Ａ￣１２５～３５处理组海马神经元内ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ表达均较对照组减少（Ｆ一６０２．１，Ｐ＜０．０１）。免 疫组化结果显示，与对照组比较，Ａ８１—４０注射组大鼠基底前脑区ＳＭＡＤ６蛋白表达减少（６８１０３±１５２０比 ９６０３６±１８０４；ｔ；２０．５１，Ｐ＜０．０１），而海马区其表达增多（９６４４１士１８５２比５５０３９士１５２８；ｔ一２９．８７，Ｐ＜０．０１）；免 疫印迹结果显示，与对照组比较，ＡＩ３１—４０注射组大鼠基底前脑区ＳＭＡＤ６蛋白表达减少（０．１０４２±０．００６７比 １．０００±０．０９８６； 一１５．６９，Ｐ＜０．０１），而海马区其表达增多（１２．５５２５±２．６８０３比１．０００土０．０１３５；ｔ＝７．４６５，Ｐ＜ ０．０１）。结论Ａｐ可直接下调神经元内ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ转录及表达，不同脑区内ＳＭＡＤ６蛋白表达可能受负反 馈调节机制影响。 关键词：阿尔茨海默病；母抗Ｄｐｐ小同源物６；骨形态发生蛋白质；Ｂ淀粉蛋白 中图分类号：Ｒ７４９．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—２９６３（２０１７）０３—０１８３—０５ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＳＭＡＤ６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇｊ ｉｅ，ＡＮ Ｎａ ． Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３０，Ｃｈｉｎａ ＣｏＨｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＡＮ Ｎａ，Ｅｍａｉ１：ｎａｎａａｎ１９７８＠１２６．ｃｏｒｎ ＡＢＳＴＲＡＣＴ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐ１ｅｇｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇ ６ （ＳＭＡＤ６）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ （Ａ口）一ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５－１７ ｄａｙｓ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｔ ＳＤ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａ１３２５—３５（１０，１５，２０￣ｍｏｌ／Ｌ）ｆｏｒ ２４ ｈ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＳＭＡＤ６ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｆｔｅｒ Ａ８２５—３５ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒｅａｈｉｍｅ ＰＣＲ．Ｔｗｅｌｖｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｇｅ ｏｆ ２ ｍｏｎｔｈｓ ｏｌｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２。０～２２０ ｇ，ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ Ａｐ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ ｖｉｖｏ，ＡＢ １－４０ ｗａｓ ｂｉｌａｔｅｒａｌｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｔｏ ｓｉｍｕｌａｔｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ０ｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＡＤ），ａｎｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＳＭＡＤ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ａｎｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ Ａｅ ｇｒｏｕｐ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｆ一６０２．１，Ｐ＜０．０１）．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＳＭＡＤ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ａ８ ｇｒｏｕｐ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ（６８ １ ０３± １５２０ ｖｓ．９６０３６士１８０４； ：２Ｏ．５１，Ｐ＜Ｏ．０１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ（９６４４１± １８５２ ｓ．５５０３９±１５２８；ｔ＝２９．８７，Ｐ＜０．０１）．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＳＭＡＤ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＡＢ ｇｒｏｕｐ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ（０．１０４２±０．００６７ ｖｓ． １．０００±０．０９８６； １５．６９，Ｐ＜Ｏ．０１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ（１２．５５２５±２．６８０３ ｖｓ．１．０００±０．０１３５；￡一７．４６５，Ｐ＜Ｏ．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＡＢ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＳＭＡＤ６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｍａｙ ｂｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＡＤ６ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｒａｉｎ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇ ６；ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—２９６３．２０１７．０３．００８ 作者单位：１０００８８首都医科大学附属北京安定医院１３病区（张莹洁）；２０００３０上海交通大学医学附属精神卫生中心老年科（安娜） 通讯作者：安娜，Ｅｍａｉｌ：ｎａｎａａｎ１９７８＠１２６．ｔｏｍ ・１８４・ 中国神经免疫学和神经病学杂志２０１７年５月第２４卷第３期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆Ｎｅｕｒｏｌ ２０１７，Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．３ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一 醉大鼠，固定于ＢＡＳ立体定向仪上，将齿棒定为 一种进展性神经变性疾病，６５岁以上患病率达５ ／０４， ８５岁以上达２Ｏ ，病残、病死率高［１］。ＡＤ的主要 病理特征为 淀粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ ｐ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＩ３） ２．４ ｍｍ。前囟后１．４～１．６ ｍｍ，旁开２．５ ｍｍ， 钻颅缓慢进针深度７ ｍｍ。Ａ８注射组采用１ Ｌ的 微量注射器和微量推进器在双侧基底前脑Ｍｅｙ— ｎｅｒｔ核各注射ＡＩ？Ｉ一４０（１０ ｕｇ／ｕＬ，Ｓｉｇｍａ公司）１ Ｌ，注射时间１０ ｍｉｎ，注射完毕后，针停留５ ｍｉｎ， 缓慢拔出，然后以同样方法注射另一侧［８ ］。对照 组采用等剂量的ＰＢＳ溶液进行注射，方法同上。 形成老年斑沉积和异常细胞骨架形成神经原纤维 缠结 ］。ＡＩ３具有强神经毒性，在导致大量神经元 变性和坏死之前可先引起神经突触损伤，进而引起 认知功能障碍［３］。母抗Ｄｐｐ小同源物（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐＩｅｇｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇ， ＳＭＡＤ）与骨形态发生蛋白（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）同属转化生长因子Ｊ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｇ，ＴＧＦ￣３）超家族中的重要成员，参 与调节细胞生长、分化、凋亡等过程，由８种不同的 蛋白构成整个ＳＭＡＤ家族，通过可逆磷酸化对多 种信号传导通路进行调节Ｌ４］。ＳＭＡＤ６作为一种 抑制性ＳＭＡＤ蛋白，通过减少ＳＭＡＤ２和ＳＭＡＤ５ 磷酸化，与ＳＭＡＤ４竞争，从而抑制ＴＧＦｆｌ／ＢＭＰ信 号通路［５］。作者团队前期研究发现ＢＭＰ蛋白在 Ａｔ３毒性病变中具有神经保护作用【６。］，而作为 ＢＭＰ下游通路中抑制性蛋白ＳＭＡＤ６在ＡＤ毒性 病变中的作用尚不明确。本研究利用原代培养海 马神经元和痴呆大鼠模型探讨了ＳＭＡＤ６在ＡＪ３ 毒性病变中的表达变化以及潜在的作用。 １材料和方法 １．１实验动物 采用Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄性 大鼠１６只，２月龄，体质量２００～２２０ ｇ。购自中国 科学院上海实验动物中心，饲养于中国科学院药物 研究所实验动物中心（清洁级环境），动物的使用符 合上海市动物管理委员会管理条例。将ＳＤ大鼠 随机分为ＡＧ注射组和空白对照组，每组８只。 １。２主要试剂和仪器Ａ１３２５—３５和阿糖胞苷购自 美国Ｓｉｇｍａ公司，Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自于美国Ｉｎｖｉｔｒｏ— ｇｅｎ公司。ＳＭＡＤ６抗体（ｓｃ－１３０４８）购自于美国 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。所有化学试剂均为分析级。大 鼠立体定向仪、微量推进器、颅骨钻购自美国ＢＡＳ 公司。１ Ｌ微量注射器及手术器械购自上海医疗 器械公司。Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫图像自动采集和处理系 统由中国科学院药物研究所提供。垂直电泳槽、电 转移电泳槽购自于美国ＢｉｏＲａｄ公司。 １．３ 方法 １．３．１ 建立大鼠胆碱能神经元损伤模型：按文献 Ｅ６］方法向大鼠双侧基底前脑Ｍｅｙｎｅｒｔ神经核注 射Ａｔ？进行造模。以１Ｏ （质量浓度）水合氯醛麻 手术后第１１天开始进行水迷宫试验训练，经过５ ｄ 水迷宫训练后，采集入水后寻找到平台的时间。造 模成功标准以及水迷宫试验结果作者团队前期研 究，造模成功率１００ ［６］。水迷宫试验后取大鼠海 马和基底前脑组织冻存备用。 １．３．２原代海马神经元培养：取孕１５～１７ ｄ的 ＳＤ大鼠１只（购自中国科学院上海实验动物中 心），无菌条件下取胎鼠海马，以０．１２５ （质量浓 度）胰蛋白酶消化，加入１Ｏ （体积分数）胎牛血清 培养基终止消化，吸管吹打组织２Ｏ次，收集细胞悬 液，接种于多聚赖氨酸包被的培养板中，放入培养 箱，２４ ｈ后换不含血清的培养液（１ 谷氨酸盐＋ ２ Ｂ２７＋９７ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ，Ｇｉｂｃｏ公司），４８ ｈ后 加阿糖胞苷，作用２４ ｈ后全量换液，此后每３ ｄ半 量换液。于培养７～１０ ｄ，神经元纯度达到８Ｏ ～ ９Ｏ 后用于下一步实验。 １．３．３提取与扩增ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ：将Ａ１￣２５—３５ 溶解于０．１ Ａ（质量浓度）三氟乙酸溶液中，配成１ｏ ｍｍｏｌ／Ｌ储存液，临用前置于３７℃孵箱中孵育３ ｄ 进行老化处理，使可溶性Ａｔ？聚集成不溶性ＡＧ。 将培养的原代海马神经元随机分为４组，分别用不 同浓度Ａ［３２５—３５处理海马神经元，使ＡＢ２５—３５终浓 度分别为１０、１５、２０ ｕｍｏｌ／Ｌ；另设立阴性对照，添 加等量三氟乙酸溶液。孵育２４ ｈ后采用总ＲＮＡ 提取（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ＴＲＩｚｏ１）法提取总 ＲＮＡ。实验步骤严格按Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ试剂盒说 明书进行（Ｔａｋａｒａ公司）。用Ｂｉｏ—Ｒａｄ定量ＰＣＲ 仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）设置预变性９５℃１０ Ｓ，ＰＣＲ反 应９５℃５ Ｓ，依据相应的退火温度持续３０ Ｓ，循环 ４Ｏ次。ＳＭＡＤ６和Ｊ３一ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ基因全长由 Ｐｕｂｍｅｄ Ｇｅｎｅｂａｎｋ查得，委托上海生物工程公司 代为设计并合成。ＰＣＲ扩增引物如下：ＳＭＡＤ６： 上游：５ 一ＣＧＧＧＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＡＴＧＡ一３ ，下游： ５Ｉ＿ＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴ一３ ； １３－ａｃｔｉｎ：上 游：５，＿ＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ一３ ，下 游：５＇－ＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＡＧＧＴ－，３。ＳＭＡＤ６ 中国神经免疫学和神经病学杂志２０１７年５月第２４雀第 期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ鱼 ！ ！ ！！ ． ， ． 片段长度为１４９ ｋｐ，退火温度５４℃；ｔ？－ａｃｔｉｎ片段长 用ＩＭＳ图像分析系统（Ｎｉｋｏｎ公司）设定基础统计 面积，分别调定背景、阴性细胞、阳性细胞，通过计 算机自动分析，得出阳性表达面积及阳性强度均 度２４１ ｋｐ，退火温度６０℃。ＰＣＲ产物含量依据 ２ 计算（其中ｃｔ值代表每个反应管内的荧光 信号到达设定的域值时所经历的循环数）。每个实 验重复３次，取均数。 １．３．４ 免疫印迹分析：取Ａｔ？注射组和空白对照 值，按下列公式计算ＳＭＡＤ６表达阳性指数：阳性 指数一阳性表达面积×阳性强度均值。阳性指数 越高表示目标蛋白表达越高。每个实验重复 ３次。 组各３只大鼠冻存大脑组织，研磨制备匀浆。采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法检测蛋白浓度，细胞蛋白提取物在 １．４统计学处理采用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｈｒｉｓｍ ５软件 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶上进行电泳，采用湿转法转膜，转 膜结束后，丽春红及考马斯亮蓝染色。聚偏二氟乙 烯（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜浸入５ （质 进行分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符 合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组 均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ检验，两均数间比较采用样本ｔ检 验。取口一０．０５。 量浓度）脱脂奶粉的ＴＢＳＴ室温封闭。一抗为兔 抗大鼠ＳＭＡＤ６（１：５００）或ｔ？－ａｃｔｉｎ抗体（１：２０００， Ａｂｃａｍ公司），二抗为ＨＲＰ标记的山羊抗兔抗体 （１：５００，碧云天公司），通过电化学发光（ｅｌｅｃｔｒｏ～ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＩ ）试剂盒发光显影。采 用Ｂｉｏ—Ｒａｄ２０００型凝胶成像系统将光片在白光下 扫描后，应用Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ软件（Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）进 行灰度扫描分析。各组ＳＭＡＤ６相对含量以 ２ 结果 ２．１ 各组大鼠原代海马神经元ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ转 录水平 １０、１５、２０ ｔｚｍｏｌ／Ｉ ＡＢ处理组以及对照组 原代海马神经元ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ表达水平分别为 ０．１２８６±０．００５０、０．０６７５±０．００４６、０．０１８９±０．００３３、 ＳＭＡＤ６条带灰度值与各自３－ａｃｔｉｎ灰度扫描值的 比值表示，并设对照组。计算Ａｔ？处理组ＳＭＡＤ６ 相对蛋白含量与对照组的比值。每个实验重 复３次，结果取均数。 １．３．５免疫组化：取ＡＪ３注射组和空白对照组各３ 只大鼠脑组织进行免疫组化试验，依据ＳＰ试剂盒 说明书（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司）步骤操作。石蜡切片 １．００００±０．０６５４，各组间其表达水平比较差异有统 计学意义（Ｆ一６０２．１，Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）。与对照组比较，不 同Ａ８浓度组海马神经元ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ表达水平 均降低（均Ｐ＜Ｏ．０１）。 ２．２ 各组大鼠不同脑区ＳＭＡＤ６蛋白表达 （１） 免疫印迹分析：与对照组相比，Ａｔ？ｌ一４０注射组大鼠 基底前脑区ＳＭＡＤ６蛋白表达降低（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），而 海马区其表达升高（Ｐ＜０．０１）。（２）免疫组化：与 对照组相比，Ａｔ？ｌ一４０注射组基底前脑区内ＳＭＡＤ６ （１０ ｕｍ）常规脱蜡，３０ ９／６（体积分数）Ｈ Ｏ 窒温下 持续孵育切片１０ ｍｉｎ，以灭活内源性酶，之后切片 上滴加正常山羊血清封闭液，室温下持续孵育３Ｏ ｍｉｎ。滴加稀释好的兔抗大鼠ＳＭＡＤ６一抗（１： ５００，Ａｂｃａｍ公司），４℃过夜。滴加生物素化山羊 抗兔二抗（１：５００，碧云天公司），３７℃２０ ｍｉｎ后 ＰＢＳ冲洗，ＤＡＢ显色。细胞核内呈明确棕色染色 者即为ＳＭＡＤ６阳性细胞，蓝色染色为ＳＭＡＤ６阴 性细胞。选取同一染色条件下的６～７张切片，每 阳性细胞减少（Ｐ＜０．０１），而海马区则增多（Ｐ＜ ０．０１）。结果见表１、图１～２。 基底前脑 正常 ＡＢ 正常 海马 ＾Ｂ ｓＩＩ＾Ｄ６ ｔ 一●Ｉ ａｃｔｉｎ．．｜■ －。 （免疫印迹法） ■— ■—● 图１各组ＳＤ大鼠不同脑区ＳＭＡＤ６蛋白表达变化 张切片随机取１００个细胞，将图像摄人计算机，使 表１各组ＳＤ大鼠不同脑组织ＳＭＡＤ６蛋白表达水平比较（孑士５， 一３） 注：ＳＭＡＤ６：母抗Ｄｐｐ小同源物６；Ａｔ？：０淀粉样蛋白。图１、２同 中国｛中经免疫学和神经病学杂志２０１７年５月第２４卷第３期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ＆ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１ ７，Ｖｏ１．２ｌ，Ｎｏ．３ 注：Ａ：正常组基底前脑；Ｂ：Ａｐ注射组基底前脑；（：：正常组海马；Ｄ：Ａｐ注射组海马 图２各组ＳＤ大鼠不同脑区ＳＭＡＤ６阳性细胞（红色箭头所示）表达比较（蓝色箭头所示为ＳＭＡＤ６阴性细胞；免疫组化．×２（）（）） ３讨论 ＡＤ是以渐进性的学习、记忆、行为和人格障 碍为主要临床特征的神经精神疾病，ＡＢ在脑内的 沉积是其最典型的病理特征，Ａ８具有神经毒性，通 过产生氧化应激、代谢压力和兴奋性毒性诱导神经 元损害 。ＢＭＰｓ最初为软骨内骨形成的诱导剂 和骨代谢的调节剂，由胞浆分泌后进入细胞间隙。 与细胞膜上的ＢＭＰｓ受体（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＢＭＰＲ）相结合，激活ＢＭＰ下游 信号，包括经典的ＳＭＡＤ及非经典的ＬＩＭ激酶１ （ＬＩＭ ｋｉｎａｓｅ １，Ｉ ＩＭＫ１）等。ＳＭＡＤ６是一种抑制 性ＳＭＡＤ蛋白，可竞争性地结合Ｉ型ＢＭＰＲ或 ＳＭＡＤ４蛋白，从而抑制ＳＭＡＤ１／５／８磷酸化或者 导ＳＭＡＤ６蛋白表达增加，当ＢＭＰｓ信号通路打开 时。通过ＳＭＡＤ途径和非ＳＭＡＤ途径影响遗传物 质的转录川 。经典的ＳＭＡＤ途径最终可以作用 于细胞核，影响ＢＭＰｓ的负性调节蛋白ＳＭＡＤ６的 基因转录，当ＢＭＰｓ信号通路增强时，ＳＭＡＤ６的 转录和表达会随之增强。ＢＭＰｓ诱导的ＳＭＡ１）６ 蛋白增加是ＢＭＰｓ信号通路的负反馈调节机制之 一：ＳＭＡＤ６可抑制ＳＭＡＤ１／５／８蛋白与共享 ＳＭＡＤ４蛋白形成复合体；同时ＳＭＡＤ６可抑制非 ＳＭＡＤ通路中转化生长因子激活激酶１一丝裂原活 化蛋白激酶（ＴＧＦ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １一ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉ— ｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＴＡＫ１＿ＭＡＰＫ）信号途径； ＳＭＡＤ６还可促进ＢＭＰＲ的降解【 。ＳＭＡＤ６ 作为ＢＭＰｓ的下游信号，伴随ＢＭＰｓ的变化而变 化，从而起到负反馈平衡的作用。ＢＭＰｓ信号途径 除ＳＭＡ６外，还存在多种调节因子．包括ＢＭＰｓ拮 抗剂ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ等以及抑制性 核转移，从而下调ＢＭＰ信号系统ｌ１ 。本研究选择 ｌＯ、１５和２０／＿ｔ ｍｏｌ／Ｉ 浓度的ＡＪ３２５—３５处理培养７ ｄ的海马神经元，结果显示Ａｌａ２５—３５直接处理海马 神经元可导致ＳＭＡＤ６ ｔｕＲＮＡ转录减少；进一步 ＳＭＡＤ７蛋白和ＳＭＡＤ磷酸酶，它们均在不同传 导通路上发挥作用 ，ＳＭＡＤ６是经典的ＳＭＡＤ 信号途径在细胞核内诱导产生的抑制性ＳＭＡＤ蛋 白，不仅与ＢＭＰｓ同步变化，而且在维持ＢＭＰｓ信 号稳定上有重要作用。上述研究结果提示，在一定 强度和时间范围内的ＡＩ？毒性刺激可以激发 ＢＭＰｓ／ＳＭＡＤ６信号通路的自我调节功能。中枢 神经系统具有双向联系的特征，基底前脑和海马区 之间正是具有双向投射纤维一 ．这可以解释海马 采用ＡＪ３１—４０注射建立胆碱能神经元损伤模型，通 过免疫组化和免疫印迹方法检测基底前脑区和海 马区ＳＭＡＤ６蛋白的表达情况，结果显示，ＡＧ１—４０ 对基底前脑区神经元产生直接神经毒性，导致 ＳＭＡＤ６蛋白表达降低，这与Ａ￣ａ２５—３５直接作用于 原代海马神经元导致ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ表达水平降 低的实验结果相一致，提示ＡＪ３可直接引起 ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ转录和蛋白表达降低。作者课题 组前期研究应用水迷宫试验证实，ＡＢ卜４０双侧注 射大鼠基底前脑区可导致大鼠产生记忆认知功能 障碍 一，ＡＩ３可导致ＳＭＡＤ６的上游通路ＢＭＰ６、 ＢＭＰ７及ＢＭＰ４蛋白含量下降一 ，而作为ＢＭＰｓ 下游通路中的负性调节蛋白，ＳＭＡＤ６蛋白水平与 上诉３种蛋白的变化一致，似乎是一个矛盾的结 区ＳＭＡＤ６蛋白表达升高的原因。基底前脑胆碱 能系统包括腹侧纹状体、杏仁核、Ｍｅｙｎｅｒ核、隔核 及斜方体，隔核海马胆碱能投射纤维终止于海马区 神经元。同时，海马区神经纤维元投射到隔阂的外 侧区和内侧区，从而反馈海马区的信息一 。本研 究采用Ａｊ３１—４０注射基底前脑区建立大鼠模型，其 海马区ＳＭＡＤ６蛋白表达升高，推测海马区 果。Ｍｏｕｉｌｌｅｓｓｅａｕｘ等研究结果显示，ＢＭＰ２可诱 中国神经免疫学和神经病学杂志２０１７年５月第２４卷差 』 ！ 塾 ！ （１）：ｌ５１—１６３． ！！ ： ！ ： ・ １８７ ・ ＳＭＡＤ６蛋白上调是由于基底前脑区ＳＭＡＤ６下 调的负反馈。基底前脑区神经元受到ＡＧ１—４０的毒 性攻击，使该区域神经元受损严重，可直接导致细 胞内合成ＳＭＡＤ６的功能下降。本实验中ＡＢ注 射区为基底前脑，海马区未直接受到ＡＩ３毒性攻 击，与基底前脑区相比，海马区受毒性攻击的程度 和时间均会削弱，同时结合脑区间存在双向调节作 用，故作者推测海马区ＳＭＡＤ６因负反馈而代偿性 ［７］Ｓｕｎ Ｌ，Ｇｕｏ Ｃ，Ｗａｎｇ Ｔ，ｅｔ ａ１．ＬＩＭＫ１ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ６ ａｇａｉｎｓｔ ａｍｙｌｏｉｄ一￣－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ［Ｊ］．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ，２０１４，４２（２）：５４３—５５４． ［８］Ｂａｏ ＸＭ，Ｓｈｕ ＳＹ．Ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ［Ｂ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ，１９９１． ［９］Ｂｉｓｈｏｐ ＫＭ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＣＥＲＥ一１ １ ０（ＡＡＶ２一 ＮＧＦ）：ｔａｒｇｅｔｅｄ，ｓｔａｂｌｅ，ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ＮＧＦ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｒｏｄｅｎｔ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ 增多。本研究结果与既往研究ＢＭＰ６／ＢＭＰ７／ ＢＭＰ４在ＡＤ病变中作用的结果相似，均表明存在 海马区与基底前脑区的双向负反馈调节＿６。 。 综上所述，本研究结果显示，Ａｊ３可诱导原代培 养神经元内ＳＭＡＤ６ ｍＲＮＡ转录的下降，诱导大 鼠注射区一基底前脑内ＳＭＡＤ６蛋白表达下调，提 示ＳＭＡＤ６可能参与ＡＤ病变；基底前脑和海马区 ＳＭＡＤ６蛋白的表达可通过负反馈的方式进行自 我调节，这为研究ＡＤ发病机制提供了一种潜在的 思路。 参考文献 ［１］Ｊａｃｋ ＣＲ Ｊｒ，Ｋｎｏｐｍａｎ ＤＳ，Ｊａｇｕｓｔ ＷＪ，ｅｔ ａ１．Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｓｃａｄｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２０１０，９（１）：１１９－１２８． ［２］Ｔａｍａｙｅｖ Ｒ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｓ，Ａｒａｎｃｉｏ Ｏ，ｅｔ ａ１．８一ｂｕｔ ｎｏｔ ７一 ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＰＰ ｃａｕｓｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ２０１２，４（３）：１７１－１７９． ［３］Ｄａｖｉｓ ＲＣ，Ｍａｒｓｄｅｎ ＩＴ，Ｍａｌｏｎｅｙ ＭＴ，ｅｔ ａ１．Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ｄｉｍｅｒｓ／ｔｒｉｍｅｒｓ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｃｏｆｉｌｉｎ—ａｃｔｉｎ ｒｏｄｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆｉｌｉｎ—ｐｈ０ｓｐｈｏｒｙ１ａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ，２０１１，６（２４）：１０． ［４］庞莉，王晶。蒋延文．Ｓｍａｄ蛋白研究进展［Ｊ］．中国医学创新， ２０１３，１ｏ（１２）：１５５一ｌ５８． ［５］Ｈａｙａｓｈｉ Ｙ，Ｈｓｉａｏ ＥＣ，Ｓａｍｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＢＭＰ—ＳＭＡＤ－ＩＤ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｐｌ ６／ ＩＮＫ４Ａ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ２Ｏ１６，１１３（４６）：１３０５７－１３Ｏ６２． ［６］Ｓｕｎ Ｌ，Ｇｕｏ Ｃ，Ｌｉｕ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍ０ｒｐｈ０ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ７ ａｇａｉｎｓｔ ａｍｙｌｏｉｄ—ｂｅｔａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，１８４ ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００８，２１１（２）：５７４—５８４． ［１０］Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ Ｉ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ａ，Ｈｅｌｔｏｎ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ＮＥＵ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｆｆｅｃｔｓ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ一８ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｖｉａ ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ＿Ｊ］． Ｎａｔ ｃｏｍｍｕｎ，２０１３，４（１）：２７３４． ［１１］Ｍｏｕｉｌｌｅｓｓｅａｕｘ ＫＰ，Ｗｉｌｅｙ ＤＳ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＬＭ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｔｃｈ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＢＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｌａｔｅｒａｌ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｉｎ ｖｅｓｓｅｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｖｉａ ＳＭＡＤ６［Ｊ］．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，ｌ１ （７）：１３２４７． ［１２］Ｌｅｅ ＹＳ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｊｕｎｇ ＳＭ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ— ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ａ Ｓｍａｄ６一ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ［Ｊ］．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１５，７（５）： ５７７—５９２． ［１３］Ｂｒａｚｉｌ ＤＰ，Ｃｈｕｒｃｈ ＲＨ，Ｓｕｒａｅ Ｓ，ｅｔ ａｉ．ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ： ａｇｏｎｙ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１． ２Ｏ１５，２５（５）：２４９—２６４． ［１４］Ｆｏｒｔｉｎｉ ＢＫ，Ｔｒｉｎｇ Ｓ，Ｐｌｕｍｍｅｒ ＳＪ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ａ ＳＭＡＤ７ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ａ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ［Ｊ］．ＰＩ ｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（１１）：ｅｌ１１９１４． ［１ ５］Ｂａ￣ｕｅｌｏｓ Ｃ，ＬａＳａｒｇｅ ＣＬ，ＭｃＱｕａｉｌ ＪＡ，ｅｔ ａ１．Ａｇｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｒｏｓｔｒａｌ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｓｐａｔｉａｌ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，２０１３，３４（３）：８４５—８６２． ［１６］Ｇｙｅｎｇｅｓｉ Ｅ，Ａｎｄｒｅｗｓ ＺＢ，Ｐａｘｉｎｏｓ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｉｎ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｏｆ ｍｉｃｅ，ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｃｏｒｔｉｃｏｐｅｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ＿Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒａｓ Ｂｕｌｌ，２０１３，９４（５）：１－８． ［１７］安娜、孙琳．股形态发生蛋白４在Ａ０诱导的神经毒性病变中 的表达变化［Ｊ］．中国神经免疫学和神经病学杂志，２０１５，２２ （４）：２３３－２３６． （收稿日期：２０１６－０９—０４） （本文编辑：时秋宽）
