针刺对抑郁大鼠海马GAD65、GAD67作用研究

Vol. 33

No. 1

2018

河北中医药学报

JOURNAL OF HEBEI TCM AND PHARMACOLOGY

针刺对抑郁大鼠

海马GAD65GAD67作用研究

、

*

云南中医学院针灸推拿康复学院

袁恺张黎恒赵日霞郭瑾凌娴段必双陈兴华A何新芳A

刘海静（昆明650500)

提要目的：研究针刺治疗对抑郁模型大鼠海马谷氨酸脱羧酶65 (GAD65)、谷氨酸脱羧酶67 (GAD67)的 蛋白表达水平，探讨针刺疗法的抗抑郁作用及其相关作用机制。方法：将100只大鼠随机分成5组，空白对照组、 氟西汀组、针刺非穴组、针刺穴位组以及模型组，各组均20只，采用慢性综合应激法建立抑郁模型，各组进行相 应干预21 d，观察治疗前后大鼠行为学变化。并在实验结束后，从以上5组大鼠中，每组随机抽取8只，Western Blot法检测海马区GAD65、GAD67蛋白表达水平。结果：与空白组相比，实验21 d后，模型组、针刺组、非穴位 针刺组的垂直运动次数明显减少，差异有非常显著性（P <0.01)，模型组GAD65蛋白表达量降低，差异有显著 性（P <0.05);与模型组相比，氟西汀组和针刺组体质量增幅较大、糖水摄人量明显增加、水平运动次数明显 增加、垂直运动次数明显增加，差异有非常显著性（P <0.01)，针刺穴位组GAD65蛋白表达量升高，差异有显 著性（P <0.05); 5组间GAD67蛋白表达水平差异无显著性（P >0.05)。结论：对慢性复合应激大鼠百会、三 阴交以及内关等穴实施针刺，能够在一定程度上缓解其抑郁状态；穴位针刺的抗抑郁作用可能与增加GAD65合 成、减少海马谷氨酸（Glu)含量、增加y-氨基丁酸（GABA)含量有关。

关键词针刺疗法；抑郁症；谷氨酸脱羧酶65;抗抑郁；氟西汀胶囊中图分类号：R2-03

文献标识码：A

文章编号：1007 -5615(2018)01 -0005 -04

Mfect of Acupuncture on Regulation of GAD65 and GAD67

In Hippocampus of Depression Rats

College of acupuncture and Tuina Rehabilitation，Yunnan University of TCM YUAN Kai ZHANG Li-heng ZHAO Ri-xia GUO Jin LING Xian DUAN Bi-shuang

CHEN Xing-hua HE Xin-fang LIU Hai-jing ( Kunming 650500 )

Abstract

Objective ： to study the effect of acupuncture on regulation of GAD65 and GAD67 expressions in hippocampus of de­

explore the antidepressant effect

group，Fluoxetine group comprehensive stress

and related and

mechanisrm

of acupuncture

pression rats, and to divided into 5 group has 20

therapy

groups ： control rats. Chronic

non-acupoint acupuncture group，acupuncture

establish depression

method was employed to

sponding intervention for 21 d to observe the ethological changes before and ater treatment in rats. After the experiment, 8 rats in each group were randomly selected from the 5 groups，ad the expression of GAD65 and GAD67 protein in the hippocampus was detected by Western Blot Results： Compared with the control group，ater21 d，vertical motions of model group，acupuncture group and non-acu­point group were significantly reduced，the difference was significant ( P < 0. 01)，ad the expression of GAD65 in the model groupdecreased significantly ( P < 0. 05 ) ; compared with the model group，the body weights of Fluoxetine group and acupuncture group in­creased considerably，sucrose intake increased significantly，the numbers of horizontal movements and vertical movements increased significantly，and there was significant difference ( P < 0. 01) ； the expression of GAD65 of the acupuncture group increased signifi­cantly (P < 0. 05 ) with

great differencc； there was no significant difference between

GAD67 expressions of the 5 groups

0. 05) . Conclusion： The implementation of acupuncture on chronic stress rats at DU 20 (bai hui) and SP 6 ( san yin jiao) and PC 6(nei guan) can relieve the depression status the synthesis of

Key words

in

a certain extent； the conteet，and

antidepressant

effects

of acupuncture

GAD65，reducing glutamate (Glu) increasing gamma aminobutyric acid (GABA) co

acupuncture； depression； glutamic acid decarboxylase (GAD) 65； anti-depression； Fluoxetine capsule

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抑郁症属情感或心境障碍性疾病，此病发生几 率同生物遗传因素存在紧密关联，“抑郁心境”自 我体验为本病的主要症状。1它具有高发病率、高 致残率和高自杀率的特点，严重威胁人们的健康和 生命。目前临床应用的抗抑郁药物仍不能取得满意 的疗效，部分患者还存在副作用、对药物依赖性和 容易复发等问题。近年来，针灸治疗抑郁症也取得 了良好的疗效，但缺乏有力的实验证据支持。故本 实验采用禁水、禁食、摇晃、夹尾、束缚、冰水游 泳、电击大鼠足底和昼夜颠倒等慢性综合应激法建 min实施1次刺激，单次刺激时间为10 S，次数为

30次）以及昼夜颠倒等，每日实施1种随机确定 的应激刺激方式，每种刺激方式应用次数为2次。 避免2d内出现同一种刺激，由此确保动物难以预将

的刺 方 。

1.5干预措施空白对照组以及模型组不采取 干预。其他3组在开展模型构建的同时进行为期 21 d的干预治疗。

1.5.1 针刺穴位组：参考华兴邦等[]撰写的 《大鼠穴位图谱的研制》定位大鼠穴位，取百会、 立抑郁模型，以大鼠海马谷氨酸脱羧酶67 (GAD67)以及谷氨酸脱羧酶65 (GAD65)的蛋白 表达为切入点，对针刺在抗抑郁方面可能机理进行 分析，以期为针刺治疗抑郁症的临床应用提供更可 靠、更客观的依据。1

材料与方法

1.1实验动物成年SD大鼠100只，体质量

220 ~290 g，雌雄各半，取自昆明医科大学实验动 物中心，清洁级，其合格证号：0024180。实验前， 于实验室内对大鼠进行为期1周的适应性驯养，实 验室温度为（25 ±2)°C,7:00至19:00时间段给与 光照,19:00至次日7 :00时间段给与黑暗环境。在

此期间，动物自由饮食。

1.2 实验试剂及药物 Anti - GAD67、Anti -

GAD65等均购于Abeam公司。盐酸氟西汀胶囊， 购于苏州中化药品工业有限公司，规格：20 mg/ 粒，产品批号：53514007。

1.3针具针具选择32号揿针，购自北京中研 太和医疗器械有限公司。

1.4造模与分组100只成年SD大鼠，雌雄各 半，适应性饲养1周后，采用随机数字表法将大鼠

分为以下5组：空白对照组、模型组、氟西汀组、 针刺非穴组以及针刺穴位组，各组均为20只。除 空白对照组，其他4组均通过慢性综合应激法进行 抑郁模型的构建。参照Katz等[2]的方法，从饲养 第8 d起，对除空白对照组外的另外4组大鼠进行 应激刺激，刺激过程共21 d。刺激涉及以下项目： 禁水（24 h)、禁食（48 h)、摇晃（1 \"/s，15

min)、夹尾（1 min)、束缚（3 h)、冰水游泳

(4°C, 5 min)、电击足底（1mA电流强度，每隔1 *

*

国家自然科学基金项目：No. 81260555;云南省科技厅应用基础 研究面上项目：No. 2011FZ161

A

广州中医药大学针灸康复临床医学院（广州65〇021)

通讯作者：刘海静，女，教授。

内关以及三阴交，具体步骤如下。⑴百会穴，此穴 所用针具为32号麦粒型皮内针，针身长度2 mm。 消毒后，左手固定大鼠头部，右手持慑子将针柄夹 住，穴位对准后，向印堂方向平刺刺入穴位，同时 用胶布对针柄加以固定。每次留针30 min，1次/

d。⑵内关与三阴交，此2穴所用针具为32号图钉

型皮内针，针身长度5 mm。消毒后，用左手将大 鼠相应肢体固定住，右手持慑子夹住针柄。穴位对 准后，通过直刺法将针刺入，同时用胶布对针柄加 以固定。每次留针30 min，1次/d。

1.5.2针刺非穴组：选择百会、内关、三阴交 旁的非穴位点实施针刺，针具、针刺方法、留针时

间以及疗程等均同针刺组。1.5.3氟西汀组：将氟西汀（按大鼠体质量1.8 mg/kg)溶于2mL纯净水中进行灌胃，1次/d。2观测指标

2.1 对每组大鼠的一般状态进行观察（如体质

量、精神以及进食等）

分别于造模第1 d及第21

d对大鼠的体质量、进食与精神状况加以记录。

2.2糖水消耗实验在模型构建的首日以及第 21 d，让5组中的每只大鼠任意饮用以下2种不同 类型的水：一瓶为自来水，另一瓶为含1%蔗糖的 自来水。通过对饮水瓶重量进行称量以计算出当日

7 :00AM至次日7 :00AM 2种水的饮用量，对各组 大鼠蔗糖消耗量情况进行比较分析。2.3 Open - Field法行为测定将准备好的旷场 实验箱（高40 cm;底部为正方形，边长为60 cm) 借助线条将箱底划分为边长为20 cm的9个正方形 小格。实验时首先将大鼠轻放于中间小格内，同时 在光亮环境中借助摄像机开展不间断摄像，观察大 鼠3 min内的活动情况。其中，水平活动得分取决 于大鼠穿越实验箱底部的块数，垂直活动得分为取 决于大鼠直立次数。于造模第1、21 d分别进行测， 每次时 为 3min。

2.4组织处理在实验结束时随机抽取每组中

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的8只大鼠，将10%的水合氯醛按3. 5 mL/kg的 剂量经腹腔注入大鼠体内。成功麻醉后，将大鼠头

部切下，取出脑组织，在冰盘中迅速将2侧海马分 离取出，并置于液氮罐中。

2. 5观察项目采用Western Blot法检测海马 区GAD65、GAD67蛋白表达。

2.6 统计学方法 数据分析软件采用SPSS17.0,计量资料以* ±^表示，组间对比采用

表1时间实验前实验后

n100100

空白组210.50 ±9.54320. 33 ±16.71

单因素方差分析，组间两两对比采用LSD法；计 数资料采用卡方检验。P <0. 05为差异有显著性。3

结果

3.1对大鼠体质量的影响与空白组相比，模 型组、非穴位针刺组体质量增幅较小，差异有非常 显著性（P <0.01);与模型组相比，氟西汀组和 针刺组体质量增幅较大，差异有非常显著性（P <0.01)。详见表1。

(g，尤±〇

针刺组211.33 ±9.24310. 69 ±18. 66^

非穴位针刺组212. 30 ±9. 84285. 37 ±19. *

5组大鼠体质量状况对比模型组211.32 ±9. 95273. 12 ±15.40*

氟西汀组210. 07 ±8. 92319.42 ±18. 75a

注：与空白对照组比较，* p<0.01;与模型组比较，▲ P <0.01

3.2对大鼠蔗糖水摄取量的影响实验21d 后，与空白组相比，模型组、非穴位针刺组糖水摄

量 降低，有非常 性(P <0.01);

表2时

前后

n100100

空白15. 00±5. 8619.19±3.74

对比模型组，氟西汀组、针刺组2组的糖水摄入量明显增加，差异有非常显著性（P <0.01)。详见

表2。

(mL,，^±5 )

针刺16.24 ±4.019. 27 ±4. 20^

非

针刺

14.97 ±4.5410.45 ±4.73*

5组大鼠蔗糖水摄入量的比较

模型15.73 ±3. 0812. 36 ±3.05*

氟西汀组14. 13 ±4.0318. 30±3.67^<0.01

注：与空白对照组比较，* P <0.01;与模型组比较，

3.3 Open - field法行为测定结果比较与空白 组相比，模型组、氟西汀组、非穴位针刺组的水平 运动次数明显减少，模型组、针刺组、非穴位针刺 组的垂直运动次数明显减少（P <0.01);与模型 组相比，氟西汀组、针刺组的水平运动次数明显增

表3项目 水平次数 垂直次数

n100100

空白组53.22 ±11.45

20.17±7.28

加，氟西汀组、针刺组的垂直运动次数明显增加 (P <0.01);与氟西汀组比较，针刺组的垂直运 动次数明显减少（P <0.05);与针刺组相比，氟 西汀组的水平运动次数明显减少（P <0.05)。详 见表 3。

(次数，尤±s )非穴位针刺组29.56 ±11.82* 9. 74 ± 3. 23 *

5组大鼠第21 d Open-Field法行为方面测定比较

模型组21.98 ±9. 35* 7.08 ±3.57*

氟西汀组45. 33 ±10. 56*“ 19. 30 ±4. 68^

针刺组51.75 ±12. 12^ 14.78 ±5.91 *▲#

注：与空白对照组比较，* P <0.01;与模型组比较，△ P <0. 05

<0.01;与氟西汀组比较，#尸<0.05;与针刺组比较，

3.4海马GAD65、GAD67蛋白表达水平比较 与空白组相比，模型组GAD65蛋白表达量降低， 差异有显著性（P <0.05);与模型组比较，针刺

表4项目GAD65GAD67

n100100

空白1.88 ±0.93

1.74±0.49

穴位组GAD65蛋白表达量升高，差异有显著性（P <0.05)。5组间GAD67蛋白表达水平差异无显著性（P >0.05)。详见表4。

(；c±,s )

针刺1.67 ±0. 45^1.48 ±0.87

非

针刺

5组大鼠海马GAD65、GAD67蛋白表达比较

模型组0.92 ±0. 34*1.30 ±0.67

氟汀1.44±0.571.73 ±0.

1.32±0.461.62±0.79

注：与空白组比较，* P <0.05;与模型组比较，AP <0.05

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4讨论

当前围绕抑郁症构建的动物模型主要有以下几

制导致Glu含量增多以及GABA含量减少。GAD65 和GAD67是GAD的2个主要同工酶，GAD67主要 负责合成神经元代谢池内的GABA，[7]而GAD65主 要合成突触释放的GABA。8

本实验显示，慢性不可预知性应激可使大鼠海 马内与Glu转化密切相关的GAD表达发生变化， 其中GAD65蛋白表达水平显著下降，而对GAD67 无明显影响，提示慢性综合性应激状态下大鼠抑郁 的发生可能由于其海马内GAD65蛋白表达水平的 种：应激模型、孤养模型、转基因动物模型、生化 改变模型以及药物诱发模型等若干，其中慢性不可 预知性应激（CUMS)模型在抑郁症行为学表现以 及发病机理方面同人类较为相似，所以为目前广泛 使用的抑郁模型之一。本实验采用CUMS方法所造 模型的模型组大鼠，与空白对照组大鼠在行为学方 面的比较差异有显著性。在此实验中，大鼠水平运 动分值下降，反映出其活动度减弱；垂直运动分值 下降，反映出面对新鲜环境动物所表现出的好奇度 减弱；糖水消耗量减少，则表示动物奖赏反应水平 减弱。以上表明，本模型较好地模拟了抑郁症临床 表现中的抑郁状态，造模成功。

目前，对于抑郁症的治疗比较棘手。而氟西汀 是经典的抗抑郁药，疗效肯定。此外，也有相关研 究证实，针对抑郁模型动物在强迫游泳状态下所表 现出的类抑郁样反应，氟西汀效果显著。[4]所以在

对CUMS抑郁动物模型进行干预时，鉴于氟西汀的 有效性与可靠性，经常将其作为阳性对照药物。因 此，本研究采用抗抑郁代表药氟西汀作为对照药 物，研究针刺抗抑郁的中枢影响机制，为临床应用 提供科学依据。

实验结果表明，针刺治疗及氟西汀治疗均可使 抑郁模型大鼠的体质量和蔗糖水摄入量显著增加， 抑郁症状缓解，而氟西汀是国际公认的抗抑郁药， 提示针刺亦具有较好的改善抑郁动物行为变化的效 果。与氟西汀组相比，针刺组大鼠的垂直运动次数 明显减少，水平运动次数明显增加，提示针刺治疗 在增强大鼠的活动度方面优于氟西汀治疗；而大鼠 对新鲜环境所表现出的好奇度方面，氟西汀治疗明 显优于针刺治疗。以上也提示在抑郁症的治疗过程 中，针刺和氟西汀可能作用于不同的靶点。

另外,谷氨酸（Glu)和7 -氨基丁酸（GABA)是 已知的最为典型的脑内兴奋性和抑制性神经递 质,[5]大脑的正常活动依赖兴奋性神经递质Glu和 抑制性神经递质GABA。而当Glu浓度过高时，则 会对大脑神经元产生兴奋性毒性，造成神经元细胞 损伤，使人出现抑郁情绪。脑内Glu和GABA在代 谢过程中有着紧密的联系，二者代谢所依托的循环 通路主要是Glu/GAB A - Gln。⑷而GAD则是

Glu/GABA - Gl这条代谢环路的关键因子之一。 GAD既是Glu的降解酶，又是GABA合成的关键

酶，是Glu转化为GABA的主要代谢酶，该酶的抑

下降，导致Glu含量的增加以及突触释放GABA含 量的减少，而过多的兴奋性神经递质Glu对神经元 产生兴奋性毒性作用造成的。针刺组通过对百会、 内关、三阴交等3穴的刺激，对GAD65蛋白表达 的失衡有较好的调节作用，而氟西汀对GAD65蛋 白表达无显著影响。提示针刺百会、内关和三阴交 抗抑郁的作用途径，可能与Glu/GABA - Gln循环 通路的关键因子一

GAD65的合成增加有关，

GAD65的高表达促使了 Glu的转化失活增加，使

大鼠海马Glu含量减少，减轻其对神经元的兴奋性 毒性，同时加速GABA的合成，最终起到抗抑郁 的效果。

参考文献

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中华医学会精神科分会.中国精神障碍技术与诊断标准[S] .3

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(2017-12-11 收稿）