高中生物复习-例析菌落等微生物数目统计计数方法的几个常见问题
1、从方法上分析菌落数目
例1 ：若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用 直接计数;若要测定其活菌数量，可选用 法进行计数。
例2 ：Ⅱl号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是 。
(参:血细胞计数板 稀释涂布平板法 稀释涂布平板法) 显微镜直接计数法是利用显微镜、血细胞计数板等工具对纯培养悬浮液直接计数来检测样本中的细胞数目。该方法能直观、快速地检测出单细胞状态下的微生物或丝状微生物所产生的孢子的数目，但是不能区分死细胞和活细胞，不适合细胞密度低的样品。
稀释涂布平板法常常需要先将样品进行一系列的稀释，然后吸取适量稀释样品涂布在平板上，在稀释度适宜的情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的，从而通过统计平板上的菌落数来推算活菌数。该方法能灵敏地检测出样品中的活菌数，但实验过程手续繁、耗时长、影响因素较多。
显微镜直接计数法由于不能区分死菌和活菌，因此计数结果往往比实际活菌数偏高。为避免把死菌计数在内，可用台盼蓝染色:被染成蓝色的为死菌，反之为活菌。稀释涂布平板法测定活菌数目的时候，由于相邻两个或多个细胞连在一起，可能形成一个菌落，因此测定值比实际值小。 2、从对照原则上分析菌落数目
例3：若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了 现象。若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法 (填“正确”或“不正确”)。
(参∶污染 不正确)
设置不接种的空白培养基作为空白对照组，证明培养基制备过程中没有被杂菌污染，增强实验的说服力，保证实验结果的准确性。若该培养基上出现了菌落则说明实验过程出现污染现象，应舍弃数据，查找原因，重做实验。
若为了证明选择培养基有选择作用，对照组往往是完全培养基。例如，为了验证以尿素为唯一氮源的培养基具有选择作用，应以在每个稀释度下分别接种牛肉膏蛋白豚培养基作为对照组，统计两种培养基的菌落数目。 在相同稀释度下，选择培养基上允许能分解尿素的菌类(还可能有土壤中的自生固氮菌)存活，而牛肉膏蛋白胀培养基上允许土壤中几乎所有菌类都能生存，因此若牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数比选择培养基的菌落数多﹐则说明该培养基有选择作用。
3、从重复性原则上分析菌落数目
例4：甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果:
甲同学涂布了3个平板﹐统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133。 乙同学涂布了3个平板﹐
统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124.
有人认为这两位同学的结果中﹐乙同学的结果可信度低，其原因是:
(参:正确稀释后涂布平板﹐平板上的菌落数为30~300之间，乙同学的结果中三个平板的菌落数有一个只有27。)
在采用稀释涂布平板法进行计数时﹐必须设置3个稀释度并且成梯度，每个稀释度重复3次以上，取平均值，避免结果的偶然性，使结果更加准确可靠24从实验数据上分析菌落数目平板中菌落数量太少会导致计数误差太大，菌落数太多会造成计数上的困难，因此国际上通用的菌落计数原则是以平板上出现30~300个菌落数的平板为计数标准例。
上述例4中，乙同学的结果中三个平板的菌落数有一个只有27，因此不能用于计数。
若上述乙同学的结果中三个平板的菌落数分别是30、169和176，能取三者的平均值作为实验结果吗？对于数据的变异程度﹐最重要的度量方法是标准差。参照平板菌落数的允许差值如表1
三个平板的菌落数分别是30、169和 176，平板菌落平均数125处于101~300之间，标准差所允许差值为±≤50，运用标准差公式计数﹐上述例题标准差为82，已经超出允许范围。
因此，同一稀释度的3次重复菌落数处于30~300的范围内时，若数据相差较大，超过允许的差值﹐也应舍弃。舍弃数值30后不足三个平板，也不能用菌落数为169和 176这两个平板的平均值来推算样品中的活菌数﹐而应找出原因并重新实验。菌落数目统计需注意的问题还有很多﹐如稀释倍数比较小时会导致更多的菌落重叠在一起形成单个菌落，从而导致实验结果小于稀释倍数大的实验组等情况。
4.微生物计数方法
二硝基甲苯遇碱变红，如图表示从被二硝基甲苯污染的土壤中分离具有降解二硝基甲苯能力的光合细菌——球形红细菌的过程。请回答下列问题：
(1)将10 g土壤样品加入装有无菌水的三角瓶中制备土壤浸出液。②过程的目的是____________________；③过程所用的接种方法为______________法。 (2)在5个培养基平板上分别接种稀释倍数为105的土壤样液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，则每毫升土壤样液中的细菌数量约为__________________个。用此方法测定的球形红细菌数量比实际活菌数量少，原因是_________________________________。
(3)图中甲、乙培养基需置于有光条件下培养，主要原因是____________________。挑出纯化获得的菌落接种在含二硝基甲苯的培养基中，培养结束后，可通过____________________________________________来判断菌种降解二硝基甲苯的能力。 解析：(1)图中②稀释涂布平板接种的目的是获得单个菌落；由图中菌落的分布可知，③过程所用的接种方法为平板划线法。 （2）在5个培养基平板上分别接种稀释倍数为105的土壤样液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191，一般取菌落数在30～300之间的平板计数，则每毫升土壤样液中的细菌数量为156＋178＋1913×105÷0.1＝1.75×108个。用此方法测定的球形红细菌数量比实际活菌数量少，原因是一个菌落可以由一个或多个球形红细菌形成。 (3)由于球形红细菌进行光合作用需要光，因此图中甲、乙培养基需置于有光条件下培养。挑出纯化获得的菌落接种在含二硝基甲苯的培养基中，由于二硝基甲苯遇碱变红，因此培养结束后，可通过调节培养基的pH至碱性后观察培养基颜色来判断菌种降解二硝基甲苯的能力。 答案：(1)获得单个菌落 平板划线 (2)1.75×108 一个菌落可以由一个或多个球形红细菌形成 (3)球形红细菌进行光合作用需要光 调节培养基的pH至碱性后观察培养基颜色 拓展 微生物计数方法 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法) 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长利用特定细菌计数板或血细原理 的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活胞计数板，在显微镜下计算菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出一定容积的样品中微生物的样品中大约含有多少活菌 数量 每克样品中的菌落数＝CV×MC：某稀释度每毫升原液所含细菌数：每公式 下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板小格内平均细菌数×400×140×稀释倍数 时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 缺点 当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察不能区分细胞死活 到的只是一个菌落 结果 比实际值偏小
比实际值偏大
