维普资讯 http://www.cqvip.com ８３８ ＣｈｉｎＪ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏ１）２００７，２３（９ ＩＳＳＮ１００７—８７３８细胞与分子免疫学杂志（・论著・ 文章编号：１００７—８７３８（２００７）０９－０８３８—０３ 抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定 郝贵杰，沈锦玉，曹 铮，潘晓义（浙江省淡水水产研究所，浙江湖州３１３００１） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ 株哈维氏弧菌发生反应外，还与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶 ｍＡｂ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ 血弧菌发生免疫交叉反应，但不与拟态弧菌、鳗弧菌、嗜水气 单胞菌等发生交叉反应。ＥＬＩＳＡ检测１Ｂ７腹水对ＧＹＣｌｌ０８—１ ＨＡＯ Ｇｕｉ－ｊｉｅ，ＳＨＥＮ Ｊｉｎ—ｙｕ，ＣＡＯ Ｚｈｅｎｇ，ＰＡＮ Ｘｉａｏ—ｙ／ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｈｕｚｈｏｕ ３１３００１， Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＡＩＭ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｍＡｂ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ： ８－ｗｅｅｋ－－ｏｌｄ ｆｅｍａｌｅ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｈ－－ ｏｇｅｎｉｃ ｈａｒｖｅｙｉ ＧＹＣ１ １０８—１．ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒ０ｍ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｇｒｅａｔ ｙｅｌｌｏｗ ｃｒｏａｋｅｒ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｃｈｉｎａ ｉｎ ２００３． Ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｃｌｍ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｔｆｈ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｐ２／０一Ａｇ一１４ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ． ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｙｔ ｏｆ ｍＡｂｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｉｌｕ— ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｕｂｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｒｅｅ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ，５ ｍＡｂｓ ａｇａｉｎｓｔ ＧＹＣ１ １０８—１ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｙｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ １ Ｂ７ ｒｅａｃｔｅｄ ｏｎ ｈａｒｖｅｙｉ． ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ａｎｄ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ｂｕｔ ｄｉｄ ｎｏｔ ｒｅａｃｔ ｏｎ ｍｉｍｉｃｕｓ， ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ １４ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｅｓｔｅｄ．１ Ｂ７ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０ ＣＦＵ／ｍＬ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｍＡｂｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｏｆ ｈａｒｖｅｙｉ ｉｎ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ｒａｐｉｄｌｙ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ；ｉｎｄｉｅｒｃｔ ＥＬＩＳＡ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ［摘要］ 目的：研制抗哈维氏弧菌特异性单克隆抗体（ｍＡｂ） 并进行免疫学特性分析。方法：以哈维氏弧菌ＧＹＣ１１０８—１颗 粒性抗原免疫８周龄雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，５次免疫后取其脾细 胞与Ｓｐ２／０一Ａｇ一１４骨髓瘤细胞融合。用间接酶联免疫吸附试 验（ＥＬＩＳＡ）对杂交瘤进行筛选，并鉴定ｍＡｂ特异性及敏感 性。结果：各株阳性克隆经３次亚克隆后，共获得５株抗 ＧＹＣ１１０８—１的ｍＡｂ，其中１Ｂ７的细胞上清及腹水效价分别为 １：３ ２００和１：３２ ０００，交叉反应结果表明１Ｂ７除了与测试的多 收稿日期：２００６—１２—１２：接受日期：２００７—０ｌ—ｌ９ 基金项目：浙江省科技厅重点项目资助（２０ｏ５Ｆｌ２０ｏ５） 作者简介：郝贵杰（１９７９一），女，安徽六安人，研究实习员，硕士 Ｔｅｌ：０５７２—２Ｏ４ｌ４０３：Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｅｌｉｓｓａ５１１＠ｓｉｎａ．ＣＯｒｎ 的敏感性达１０ ／Ｌ。结论：制备的抗哈维氏弧菌ｍＡｂ可为哈 维氏弧菌的检测及防治等提供有用的试剂。 ［关键词］哈维氏弧菌；问接ＥＬＩＳＡ；单克隆抗体 ［中图分类号］Ｑ８１３．２ ［文献标识码］Ａ 弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ）是海洋环境中常见的细菌类群之 一，其中某些种类会使水产动物致病，给渔业生产造 成损失，其致病性受宿主的生存状态及水质环境条 件等综合因素的影响较大，属条件致病菌。其中哈 维氏弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｎ ）是引起水产动物发病的一种 重要病原，能引起鱼、虾等多类海水养殖动物发 病¨’ ，造成很大的危害。目前在印度、泰国、印度 尼西亚、菲律宾、澳大利亚中国及地区等都 有报道发病 ’ 。目前，尚缺乏对此种菌的快速检测 及预防措施，我们采用杂交瘤技术，选取１株分离自 患病大黄鱼（浙江台州深水网箱养殖大黄鱼）的病原 菌哈维氏弧菌ＧＹＣ１１０８—１作为抗原，首次制备了抗 哈维氏弧菌的单克隆抗体（ｍＡｂ），为该菌的快速诊 断及预防免疫机制提供实验基础。 １材料和方法 １．１材料哈维氏弧菌标准株１．１５９３（购自中科院微生物所 菌种保藏中心）、哈维氏弧菌ＧＹＣ１１０８—１（本实验所用免疫 菌）、哈维氏弧菌ＢＫ一１、ＮＳ、哈维氏弧菌ＮＢ株（ＢＫ一１为患病 黑鲷的病原菌，ＮＳ为南美白对虾发光病病原菌，ＮＢ株由宁 波大学赠送）、副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）ａ株、ｂ株 分别由宁波大学、上海水产大学赠送，溶藻弧菌ＮＢ株（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｕｌｙｔｉｃｕｓ）由宁波大学赠送，鳗弧菌Ｅ３—１（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａ— ｒｕｍ）、拟态弧菌ＣＬ９８１１６（Ｖ／ｂｒ／ｏ ｍｉｍｉｃｕｓ）、麦氏弧菌ＧＹＣ９１０ （Ｖ／ｂｒ／ｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉ）、鱼类“暴发病”病原菌ＢＳＫ一１０（嗜水气 单胞菌）和青虾致病菌ＱＸＬ一１（嗜水气单胞菌）为本实验室分 离，草鱼肠炎致病菌５８—２０－９购自中科院水生所。 １．２方法 １．２．１颗粒性抗原的制备将哈维氏弧菌ＧＹＣ１１０８—１接种于 含１５ Ｌ ＮａＣＩ的ＴＳＡ培养基中，３０％培养２４ ｈ，加人５ Ｌ甲 醛，４℃静置过夜灭活细菌。离心弃上清，沉淀用灭菌生理盐 维普资讯 http://www.cqvip.com １ＳＳＮ１００７—８７３８细胞与分子免疫学杂志（Ｃｈｉｎ—Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ ｌｍｍｕ—ｎｏ１）２００７，２３（９ 水（８．５ ｓ／Ｌ ＮａＣ１）洗涤３次，重悬于灭菌生理盐水中，测定 ８３９ ２结果 ２．１ ｍＡｂ筛选及杂交瘤细胞系的建立采用上述免疫和融 Ａ 值，根据公式计算浓度，保存一２０℃中备用。 １．２．２动物免疫取约１０ ｃｅｌｌｆＬ的哈维氏弧菌ＧＹＣ１１０８—１ 合方法，用间接ＥＬＩＳＡ试验检测细胞培养上清，共获得了５ 株抗ＧＹＣ１１０８．１ ｍＡｂ的细胞株，分别命名为１Ｂ７、１Ｄ７、２Ｇ８、 ３Ｇ６和３Ｈ７，杂交瘤细胞经３次亚克隆，１００％的检测孔保持 了分泌抗哈维氏弧菌的能力，经连续传代培养后，依然能够 颗粒性抗原，与弗氏完全佐剂按１：１的比例混合乳化，腹腔 注射免疫８周龄雌性ＢＡＬＢ／ｅ小鼠，０．１ ｍＬ／次。初次免疫后 ２周，抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，同法免疫。以后免疫 不再加佐剂，分别在４周、６周后各加强免疫１次，融合前 ３ ｄ腹腔及尾静脉途径再加强免疫１次。 稳定分泌抗体。 ２．２ ｍＡｂ的生物学特性５株ｍＡｂ的细胞培养上清ＥＬＩＳＡ １．２．３细胞融合细胞融合按常规方法 Ｊ，取免疫小鼠的 脾细胞与Ｓｐ２／０混合于融合管内，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ， 弃去上清，轻振融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置３７℃水 浴中预热。然后在４５ Ｓ内缓慢滴加预热的ＰＥＧ４０００溶液 １ ｍＬ，边加边轻转搅拌，然后在９０ Ｓ内缓慢加入不完全ＤＭＥＭ 培养基，终止融合。静置１０ ｍｉｎ后，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ， 弃上清，加入ＨＡＴ培养基，使细胞悬浮并混匀。加入适量饲 养细胞分装至９６孔细胞培养板，放于６０ ｍＬ／Ｌ ＣＯ，培养箱内 培养。第４～５天各孔补加１滴ＨＡＴ培养基，第９～１０天用 ＨＴ培养基换出全部ＨＡＴ培养基，并可开始检测筛选。 １．２．４ 阳性杂交瘤细胞株的筛选融合后待杂交瘤细胞长 满孔底１／３～１／２时换液，３－４ ｄ后即可取细胞培养上清进行 检测。用哈维氏弧菌全菌（用免疫小鼠阳性血清做方阵试验 决定抗原包被浓度为１０”ｅｅｌｌ／ｍＬ）包被ＥＬＩＳＡ板，加细胞培 养上清反应后，洗涤，加酶标羊抗鼠ＩｇＧ，洗涤，加ＯＰＤ．Ｈ，０ 显色，检测Ａ值，Ｐ／Ｎ＞２．１者为阳性 ｊ。 １．２．５ 阳性杂交瘤细胞系的建立与腹水制备将阳性孔中 的细胞扩大培养并及时冻存，同时按有限稀释法进行亚克隆， 至阳性率为１００％时，即可定株。然后，按Ｇｏｌｄｉｎｇ等 的方 法进行腹水的制备。 １．２．６ ｍＡｂ的生物学特性ｍＡｂ的细胞培养上清和腹水 ＥＬＩＳＡ效价测定按常规方法进行，用Ｓｉｇｍａ公司的ｍＡｂ亚类 鉴定试剂盒进行亚类鉴定。 １．２．７相加实验用相加实验确定筛选出来的ｍＡｂ是否识 别同一个抗原决定簇。取上述包被好的抗原酶标孔，每２株 阳性单克隆孔的细胞培养上清为一抗，进行问接ＥＬＩＳＡ反 应。用酶标仪测定它们反应显色后的４９０ ｎｍ波长的Ａ值，按 下列公式计算它们的相加系数：ＡＩ：［２Ａ。＋ ／（ａ。＋Ａ ）一１］× １００％，其中Ａ。＋：为相加孔的吸光值，Ａ。、Ａ 为非相加孔的吸 光值。Ａ，接近１００％，则两个ｍＡｂ识别不同的抗原决定簇， Ａ，接近０，则两个ｍＡｂ识别同样的抗原决定簇 ］。 １．２．８交叉反应挑选１４株不同的菌株扩增，并用甲醛灭 活菌体作为包被抗原，用间接ＥＬＩＳＡ的方法，检测所得ｍＡｂ 与它们的交叉反应性。 １．２．９ ｍＡｂ ＥＬＩＳＡ敏感性试验将哈维氏弧菌ＧＹＣ１１０８一ｌ 菌液稀释成不同浓度后包被ＥＨＳＡ板，在相同的条件下分别 做间接ＥＬＩＳＡ实验，确定１Ｂ７最小检出菌量，即测定ｍＡｂ ｌＢ７的敏感性。 效价及１Ｂ７ ｍＡｂ腹水的ＥＬＩＳＡ效价结果见表１。 表１ ５株ｍＡｂ的生物学特性 Ｔａｂ １ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２．３相加实验结果与腹水制备相加实验测得ｍＡｂ细胞株 １Ｂ７和２Ｇ８培养上清的相加系数接近于０，１Ｄ７和３Ｇ６培养 上清的相加系数接近于０，表明它们分别识别同一个抗原决 定簇。选择其他株未制备腹水如表１，取其腹水进行实验。 ２．４ ｍＡｂ的特异性鉴定交叉反应结果表明１Ｂ７能与多株 弧菌科细菌发生交叉反应（表２）。１Ｂ７除了与各株哈维氏弧 菌发生反应外，还与副溶血弧菌ａ、ｂ株，溶藻弧菌ＮＢ和麦 氏弧菌ＧＹＣ９１０发生交叉反应，但不与鳗弧菌Ｅ３．１、拟态弧 菌ＣＬ９８１１６、嗜水气单胞菌ＢＳＫ－１０及ＱＸＬ－１和草鱼肠炎致病 菌５８—２０—９发生交叉反应。 表２ ｍＡｂ １ Ｂ７与一些菌株的免疫交叉反应 Ｔａｂ ２ Ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍＡｂｌ Ｂ７ ｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｈａｒｖｅｙ／１．１５９３ ａｈｒｖｅｙ／ＧＹＣ１１０８—１ ａｈｒｖｅｙ／ＢＫ．１ ａｈｒｖｅｙ／ＮＳ ａｈｒｖｅｙ／ＮＢ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ａ ｐａｒａｈａｅｍｏｌ￣ｉｃｕｓ ｂ ａｌｇｉｎｔｄｙｔｉｃｕｓ ＮＢ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ Ｅ３—１ ｍｉｍｉｅｕｓ ＣＬ９８ ｌｌ６ ｍｅｔｓｃｈ￣ｉｋｏｖ ＧＹＣ９ ｌ０ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＢＳＫ一１０ Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＱＸＬ一１ Ｅｎｔｅｒ／ｔ／ｓ ｂａｃｔｅｒ／ａ ５８—２０—９ ２．５ ｍＡｂ ＥＬＩＳＡ敏感性试验用不同浓度的菌体颗粒性抗 原包被ＥＬＩＳＡ板，间接ＥＬＩＳＡ法测定哈维氏弧菌ｍＡｂ １Ｂ７的 敏感性，结果表明该ｍＡｂ腹水问接ＥＬＩＳＡ方法的检测灵敏度 为１０ 个菌细胞１ Ｌ。 维普资讯 http://www.cqvip.com ＩＳＳＮＩＯ０７—８７３８细胞与分子免疫学杂志（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ ！ ！垫（ ３讨论 展对海洋弧菌的快速诊断研究，对于早期确诊并及 时控制疾病，防止疾病进一步蔓延都具有十分重要 ＥＬＩＳＡ不但能对病原菌进行定性的研究，而且 病原菌的商品性试剂盒，更适合于野外操作及大量 还能够定量，并且可重复性强，易制成检测特定种类 的意义。 样品的检测，在病原性弧菌检测中有着突出的优点。 参考文献：目前国内外在病原性海洋弧菌的检测中已广泛应用 此种方法 ’ｍ Ｊ。哈维氏弧菌是海洋鱼类常见的病原 菌，其感染鱼类往往表现比较明显的症状，如皮肤溃 ［１］毛芝娟，刘国勇，陈昌福．大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴 定［Ｊ］．安徽农业大学学报，２００２，２９（２）：１７８—１８１． ［２］陈献稿，吴淑勤，石存斌，等．斜带石斑鱼病原菌（哈维氏弧菌） 的分离与鉴定［Ｊ］．中国水产科学，２００４，ｌｌ（４）：３１４—３１７． ［３］Ｐａｓｈａｒａｗｉｐａｓ Ｔ，Ｔｈａｉｋｕａ Ｓ，Ｓｒｉｕｒａｉｒａｔａｎ Ｓ．Ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｏｆ Ｖ／ｂｒ／ｏ ｈａｒｖｅｙ／ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｈｒｉｍｐ ｃｕｌｔｕｒｅ 疡、鳍条腐烂、尾巴溃烂；剖检可见肠道有黄白色分 泌物，肝肾肿大变色，腹腔积液等¨ Ｊ。此菌引起 的大范围发病给养殖业带来巨大的经济损失。抗哈 ｐｏｎｄｓ ｉｎ Ｔｈａｉｌａｎｄ［Ｊ］．Ｖ／ｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，ｌ１４（３）：６３—６９． ［４］王保坤，余俊红，李筠，等．花鲈弧菌病病原菌（哈维氏弧菌） 维氏弧菌ｍＡｂ及多克隆抗体的制备虽然在国外已有 记载¨ ，但国内尚未见报道。我们用甲醛灭活的哈 的分离与鉴定［Ｊ］．中国水产科学，２００２，９（１）：５２—５５． ［５］钱超，姜平，卢春，等．抗ＳＡＲＳ冠状病毒Ｍ蛋白片段单 维氏弧菌菌体免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，利用细胞融合技术 和细胞克隆技术，经筛选、克隆化得到５株能稳定分 泌ｍＡｂ的细胞系。 克隆抗体的制备与初步鉴定［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００６， ２２（２）：２１３—２ｌ５． ［６］李元，马文煜．抗沙眼衣原体黏连蛋白单克隆抗体的研制及鉴 相加实验结果表明，５株ｍＡｂ分别识别３个不 定［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，１９９６，１０（４）：４９—５１． ［７］Ｇｏｌｄｉｎｇ ＪＷ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，１９８３：５３—５４． 同的抗原决定簇。其中选择细胞培养上清效价高的 １Ｂ７制备小鼠ｍＡｂ腹水，效价达１：３２ ０００。用１Ｂ７ ［８］Ｆｒｉｎｅｔｇ Ｂ，Ｄｉａｖａｄｉ—Ｏｈａｎｉｎｃｅ Ｌ，Ｐａａｇｅｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｅｎ— ｚｙｎｌｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｗｈｅｔｈｅｒ ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉ— 腹水做交叉反应实验，结果表明哈维氏弧菌与溶藻 弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌的表面抗原拥有相似 的抗原决定基，而与鳗弧菌、拟态弧菌、嗜水气单胞 菌等菌株抗原差异较大。为了更进一步弄清不同弧 ｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．１ｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ，１９８３，６０ （３）：３５１—３５８． ［９］Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＰＡＷ，Ｘｕ ＨＳ，Ａｕｓｔｉｎ Ｂ．Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ｓｓａｙ（ＥＬＩａＳＡ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖ／ｂｒ／ｏ ｈａｒｖｅｙ／ｉｎ ｐｅｎａｅｉｄ ｓｈｒｉｍｐ 菌间的相似性，针对另两个抗原决定簇的细胞株还 需制备腹水并与各株弧菌做交叉反应，相关实验还 在进行。 １Ｂ７腹水用吸附法除去与其有交叉反应的因子， 进而测定对哈维氏弧菌的敏感性实验，结果表明间 接ＥＬＩＳＡ所能检测到的最小菌液的密度为ｌ０ ／Ｌ。 而且有很好的重复性和稳定性，表明其具有高 ａｎｄ ｗａｔｅｒ［Ｊ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３４（１）：３ｌ一３９． ［１Ｏ］张晓华，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｐ，冯娟，等．中国对虾育苗池水中哈维氏 弧菌的检测［Ｊ］．青岛海洋大学学报，１９９８，２８（１）：７Ｏ一７４． ［１１］覃映雪，池信才，苏永全，等．网箱养殖青石斑鱼的溃疡病病原 ［Ｊ］．水产学报，２００４，２８（３）：２９７—３０２． ［１２］吴后波，潘金培．海水网箱养殖高体鲕的弧菌病致病菌研究 ［Ｊ］．水产学报，１９９７，２１（２）：１７１—１７４１． ［１３］Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｈａｎｎａ ＰＪ，Ａｈｍａｎｎ Ｋ．ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｖｉｂｆｉｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｉ￣ｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃ— 度的敏感性。本检测方法简单，灵敏度高，特异性 强，并且检测时间短，有很强的实际应用前景，为开 ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎｓ，ｆｉｓｈ，ａｎｄ ｓｈｅｌｌｉｆｓｈ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９２，５８（１１）：３６９４—３７００． （上接８３７页） ［２］Ｒｉｇｇ ＫＭ，Ｓｈｅｎｔｏｎ ＢＫ，Ｂｍｔｈｅｒｉｃｋ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｙｎｐｈｏｅｙｔｅ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｉｃｕｌｒａｔｉｏｎ ｔｈｍｕｇｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ［４］Ｃａｎｎｉｓｔｒａ ＳＡ，Ｎｉｌｏｆｆ Ｊ．Ｃａｎｎｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｘ［Ｊ］．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９６，３３４（１６）：１０３０—１０３８． ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ［Ｊ］．Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９７，１０９（６）：７４７—７５３． ［３］吕先科，王寒冰，霍晓君，等．肺癌患者血清免疫抑制酸性蛋白 及Ｔ细胞亚群联合检测的意义［Ｊ］．上海免疫学杂志，１９９９．１９ （３）：１７７—１８３． ［５］辛海，陈诵芬．宫颈癌演变和发展的相关因子研究进展［Ｊ］． 实用医药杂志，２００６，２３（２）：２３４—２３５． ［６］赵宏伟．母胎界面与免疫耐受［Ｊ］．山西医科大学学报，２００４，３５ （４）：４０７—４１０．
