第３８卷２０１０年８月ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１０９６．２０１０．０１２０６分析化学（ＦＥＮＸＩＨＵＡＸＵＥ）研究简报Ｃｈｉｎｅｓｅ第８期１２０６。１２１０ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌ”ｉｅＭＣｈｅｍｉｓｔｒｙ中药致肾毒性成分马兜铃酸Ａ单抗制备及酶联免疫分析方法的建立南铁贵１何素平１谭桂玉１李刚２王保民“黄璐琦柏‘（中国农业大学农学与生物技术学院，北京１００１９３）２（吉林省农业科学院农业环境与资源研究中心，长春１３００３３）３（中国中医科学院中药研究所，北京１００７００）摘要采用活化酯法，将马兜铃酸Ａ分别与牛血清蛋白（ＢＳＡ）和卵清蛋白（ＯＶＡ）偶联，得到免疫抗原马兜铃酸Ａ－ＢＳＡ和包被抗原马兜铃酸Ａ－ＯＶＡ。利用马兜铃酸Ａ—ＢＳＡ免疫ＢＭｂ／ｃ小鼠，制得鼠单克隆抗体ＩＡＩｌ，单抗效价为２×１０４；单抗为ＩｇＧｌ类，轻链为，ｃ型；与其结构类似物马兜铃酸Ｂ、Ｃ和Ｄ的交叉反应率分别为２．８％，３．５％和３１．２％。基于抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析方法（ｉｃＥＬＩＳＡ）的ＩＣ。为１．９ｐｇ／Ｌ，检测范围为０．５—７．５斗∥Ｌ。ｉｃＥＬＩＳＡ添加【旦Ｊ收率为８６％～９７％，相对标准偏差在５．２％一１１．１％之间。利用所建立的ｉｃＥＬＩＳＡ测定了６个中药材和５个中成药中马兜铃酸Ａ的含鼍，并用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）进行了验证，其中关木通、广防己、天仙藤、马兜铃和青木香中均检测出马兜铃酸Ａ，而川木通和５个中成药中未检测到马兜铃酸Ａ。结果表明：本方法可用于中药中马兜铃酸Ａ的快速检测。关键词马兜铃酸Ａ；单克隆抗体；中药；酶联免疫分析法１引言马兜铃酸类化合物是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物，包括马兜铃酸Ａ、Ｂ、ｃ和Ｄ等…。近年来，马兜铃酸的肾毒性已引起广泛关注，各国纷纷对含马兜铃酸的中药采取管制及措施１２。Ｊ。研究表明，马兜铃酸类化合物的毒性主要由马兜铃酸Ａ或其代谢物马兜铃内酰胺所致【６’７Ｊ。因此，在检测马兜铃酸时，常选择马兜铃酸Ａ为指标性成分。马兜铃科药用植物在我国广泛使用。由于马兜铃科植物许多名称混淆，为确保临床用药的安全有效，对于疑含有马兜铃酸类物质的药用植物及制剂必须进行严格检测，制订限量用药标准。目前，检测马兜铃酸的方法主要有薄层色谱法¨Ｊ、紫外分光光度法一Ｊ、高效液相色谱法¨驯及酶联免疫分析法。…等。薄层色谱法和紫外分光光度法灵敏度较低；高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）灵敏度较高、测定准确，是目前测定马兜铃酸最常用的方法，但仪器设备昂贵，对实验人员专业技能要求高。酶联免疫分析法具有灵敏、准确、前处理简单、适合大通量筛选等优点，在医学诊断、食品安全检测、环境污染物监测等领域已得到广泛应用１２Ｊ引。Ｙｕ等¨¨利用ＥＤＣ／ＮＨＳ将马兜铃混合酸（Ａ／Ｂ）与ＯＶＡ偶联，制备了抗马兜铃酸兔多克隆抗体，但该抗体的灵敏度较差；Ｔｉａｎ等¨４１将马兜铃酸Ｂ与ＢＳＡ偶联，制备得到抗马兜铃酸Ｂ的单克隆抗体，该抗体具有较好的特异性，但灵敏度较差。本研究制备了马兜铃酸Ａ的单克隆抗体，建立了马兜铃酸Ａ的酶免疫分析技术。２实验部分Ｗｅｌｌｗａｓｈ４２．１仪器、试剂与材料ＭＫ自动洗板机，ＭｕｈｉｓｋａｎＭＫ３酶标仪（芬兰Ｔｈｅｒｍｏ公司）；高效液相色谱仪（美国５８１０Ｗａｔｅｒｓ公司），包括Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅ溶剂传输系统和Ｗａｔｅｒｓ２４８７吸收检测器；Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ国Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ公司）；９６孔酶标板（美国Ｃｏｓｔａｒ公司）。Ｒ离心机（德马兜铃酸Ａ、Ｂ（中国药品生物制品检定所）；马兜铃酸Ｃ、Ｄ（美国ＣｈｒｏｍａＤｅｘ公司）；辣根过氧化物２００９．Ｉ１—１０收稿；２０１０＿０２－０７接受·Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｈｅｒｅｉｎ＠２６３．ｎｅｔ万方数据第８期南铁贵等：中药致肾毒性成分马兜铃酸Ａ单抗制备及酶联免疫分析方法的建立１２０７酶标记羊抗鼠ｌｇＧ（ＩｇＣ．ＨＲＰ）、牛血清蛋白（ＢＳＡ）、卵清蛋白（ＯＶＡ）、Ⅳ，Ⅳ’．二环己基碳化二亚胺（ＤＣＣ）、Ｊ７￣ｒ．羟基丁二酰哑胺（ＮＨＳ）、弗氏完全佐剂、弗氏小完全佐剂、邻苯二胺（ＯＰＤ）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）和三氟乙酸（ＴＦＡ）均购自美国Ｓｉｇｍａ公司；甲醇、乙腈（色谱纯，美同ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）；鼠抗体哑型ＥＩ。ＩＳＡ鉴定试剂盒（美国Ｐｉｅｒｃｅ公司），其它化学试剂均为分析纯（北京化学试剂公司）。包被缓冲液：０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸盐缓冲液（ｐＨ９．６）；ＰＢＳ：含０．９％ＮａＣＩ的０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．５）；ＰＢＳＴ：含有０．１％（Ｖ／Ｖ）吐温－２０的ＰＢＳ；ＰＢＳＴＧ：含有０．５％（ｗ／Ｖ）明胶的ＰＢＳＴ；柠檬酸盐一磷酸盐缓冲液：含０．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ柠檬睃三钠和０．０３Ｂａｌ２．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ。（ｐＨ５．５）；底物缓冲液：在１０ｍＬ含ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ。。２∥ＬＯＰＤ的柠檬酸盐．磷酸盐缓冲液中加入４斗Ｌ３０％Ｈ：０：；终止液：２实验方法ｂ／ｅ雌性小鼠（６～７周龄，军事医学科学院）；ＳＰ２／０骨髓瘤细胞（中国兽药监察所）。ｍＬ２．２．１马兜铃酸Ａ免疫抗原和包被抗原的制备称取２．０ｍｇ马兜铃酸Ａ，溶于０．４入１００ＩＬＬＤＣＣ（２．１ｍｇＤＭＳＯ，分别加ＩＬＬＤＭＳＯ），ｍｇＤＣＣ溶解于１００ｍＬ０．１３ｍｏｌ／ＬＩｘＬＤＭＳＯ）和５０ＩｘＬＮＨＳ（１．０ｍｇＮＨＳ溶解于５０室温下搅拌反应１．５ｈ，以４０００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液。将上清液逐滴加入到蛋白溶液（２０ＢＳＡ或ＯＶＡ溶解于２．０２．２．２ＢａｌＮａＨＣＯ，溶液）中，室温下反应２ｈ。反应产物崩０．０１ｍｏｌ／Ｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ透析３ｄ，冷冻干燥，一２０ｃｃ保存。ｂ／ｃ雌性小鼠免疫以０．０１ＰＢＳ将马兜铃酸Ａ免疫抗原稀释成１．０ｇ／Ｌ，初次免疫用完全弗氏佐剂与等体积的免疫原混合，充分乳化，免疫５只小鼠，每只小鼠免疫剂量为２００“Ｌ。加强免疫用不完全弗氏佐剂乳化。免疫部位为腹腔或背部皮下。经过５次免疫后，对小鼠血清进行检测。２．２．３血清效价测定小鼠经过第５次免疫后第６ｄ，用毛细玻璃管从眼眶取少量血液，窜温静置ｌ义为吸光值（Ａ）为１．０时的抗血清最大稀释倍数。２．２．４ｈ，４℃过夜，４０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集ｍ清，４℃保存。血清效价的测定采用ｉｅＥＬＩＳＡ方法‘１５ｊ。效价定单克隆抗体的制备与抗体纯化取效价和特异性都较好的一只小鼠进行加强免疫，免疫原溶于ｏＣ静置过夜，以３０００ｒ／ｍｉｎ离心０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ进行腹腔免疫，４ｄ后取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过筛选、克隆得ｈ，４到能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，并制备腹水。腹水室温静置ｌ１０ｍｉｎ，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层采朋饱和硫酸铵法＿刮对抗体进行纯化，蒸馏水透析后冻川木通、广防己、天仙藤、青木香、关木通和马兜铃磨成细粉，过６０目筛干，一４０℃冰箱保存。２．２．５马兜铃酸提取¨７】（０．３０ｍｍ孔径），各称０．５ｇ；中成药双香排石颗粒、龙胆泻肝丸等各称１．０ｇ于试管中；以５ｍＬ甲醇浸提，超声１５ｍｉｎ；以４０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液；甲醇重复提取一次，合并两次所得溶液，氮气吹干；以２．０ｍＬ无水甲醇（ＨＰＬＣ分析）或０．Ｏｌ液。测定前经０．４５Ｉｘｍ滤膜过滤。２．２．６ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ＥＬＩＳＡ分析）溶解残余物，即得马兜铃酸提取ｉｃＥＬＩＳＡ法。峨测定马兜铃酸含量（１）包被包被缓冲液将包被抗原稀释成０．５ｍｅ／Ｉ．，加入到酶标板中，每孔２００止，３７℃温育３ｈ，ＰＢＳＴ洗板４次；（２）封闭每４１，／Ｊｌｌ入２００止封闭液，３７℃温育３０ｍｉｎ，用洗板机洗板４次；（３）竞争将标准样品和待测样品朋ＰＢＳＴＧ稀释成不同浓度，加入到酶标板中，每孔１００¨Ｌ，同时每孔加入１００乩ＰＢＳＴＧ稀释的抗体，３７℃温育３０ｍｉｎ，用洗板机洗板４次；（４）加酶标二抗用ＰＢＳＴＣ稀释羊抗鼠ＩｇＣ．ＨＲＰ，每孔加人２００止，温育３０ｍｉｎ，用洗板机洗板４次；（５）显色２．２．７每孔加入２００斗Ｌ底物ｍｒｆｌ，５斗ｍ）；柱温溶液显色；（６）终止反应一定时间后每孔加入１００ＩｘＬ终止液终止反应，在４９２ｒｉｍ下测定吸光值。ｌｔＰＬＣ法蝎‘测定马兜铃酸含量ＨＰＬＣ测定条件：Ｃ。。反相柱（２５０ｍｍｘ４．６为２５℃；流动相：水．乙腈（４０：６０，Ｖ／Ｖ），含０．１％（Ｖ／Ｖ）三氟乙酸；流速ｌｍＬ／ｍｉｎ；上样体积为２０灿Ｌ；检测波长为３９０ｎｍ。３结果与讨论３．１单克隆抗体的制备融合前４ｄ对小鼠血清进行效价与抑制率检测。选取效价高（＞８０００）、抑制好的小鼠进行加强免万方数据１２０８分析化学第３８卷疫。取加强免疫后的小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，融合率约为８６％。ｉｃＥＬＩＳＡ法检测细胞上清液，选择吸光值大于１．０的阳性孔再进行抗马兜铃酸Ａ抗体特异性检测，选择抑制率高的孔用有限稀释法进行多次克隆，筛选到一株效价与特异性均较好的单克隆细胞株，命名为１Ａ１１。将该细胞株扩大培养，制备腹水并用饱和硫酸铵法纯化抗体。３．２单克隆抗体的性质鉴定３．２．１单克隆抗体效价检测ｉｃＥＬＩＳＡ法检测抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体１Ａ１１的效价，以未免疫的小鼠血清作为阴性对照，如图ｌ抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体ｌＡｌｌ的效价约为２×１０４。３．２．２单克隆抗体特异性检测ｉｃＥＵＳＡ法检测抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体ｌＡｌｌ的特异性，抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体１Ａ１１与马兜铃酸类物马兜铃酸Ｂ、ｃ和Ｄ（图２）反应，交叉反应率分别为２．８％、３．５％和３１．２％。３．２．３单克隆抗体类型检测利用Ｐｉｅｒｃｅ公司的单抗类图１抗马兜铃酸Ａ单抗１Ａｌｌ效价检测Ｆｉｇ·１Ｔｉ钯ｒｏｆ型检测试剂盒对抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体１ＡＩ１类型进行检测（表１）。结果表明：１Ａ１１与ＩｇＧｌ类和，ｃ的吸光值分别是１．２１０和１．０２３；其它类型的ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ和入几乎没有反应。因此，抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体１Ａｌｌ为ＩｇＧｌ类，轻链为Ｋ型。ＲＩ＝ＯＣＨ３巳２Ｈ巳２ＨＲｌ＝ＨＲｚ＝Ｈｍ。ｎｏｃｌ。ｎａｌ眦ｉｂｏｄｙ（ｍＡｂ）１Ａ１１ｄｅ把珊ｉ∞ｄｉｎＥＬｌｓＡａｇａｉｎｓ‘ａ—ｓ协１０ｃｈｉｃａｃｉｄＡ马兜铃酸Ａ（ＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ）马兜铃酸Ｂ（ＡｒｉｓｔｏｌｏｅｈｉｃａｃｉｄＢ）ｃ）Ｄ）＆２ＨＲ３２ＨＫ２Ｈ～２０Ｈ马兜铃酸ｃ（ＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＲｊ＝ＯＣＨ３＆２ＨＫ。ＯＨ马兜铃酸Ｄ（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄ＆图２马兜铃酸Ａ及其类似物结构式Ｆｉｇ．２ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｅａｃｉｄＡａｎｄｉｔｓａｎａｌｏｇｓ表ｌ马兜铃酸Ａ单抗ｌＡｌｌ类型检测ＴａｂｌｅｌＩｓｏｔｙｐｅｏｆｍＡｂｌＡ１ｌａｇａｉｎｓｔａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ３．３ＥＬＩＳＡ工作曲线棋盘格实验筛选最佳包被抗原、抗体的工作浓度。确定马兜铃酸Ａ的ｉｃＥＬＩＳＡ法工作条件为：包被抗１．０原浓度０．５ｍｇ／Ｌ，抗体浓度ｏ．５ｍｇ／Ｌ，羊抗鼠ＩｓＧ—ＨｆｕＰ３．４添加回收实验川木通不含马兜铃酸类物质，向其中加入马兜铃酸Ａ，测定方法的添加回收率。添加浓度依次为１０，５．０，２．５，１．０，０．５和０．２５斗ｇ／ｇ，以不添加马兜铃酸Ａ的川木通样品为阴性对照，结果如表２。添加回收率为８６％一９７％；相对标准偏差在５．２％～１１．１％之间。ｍｇ／Ｌ。建立标准曲线如图３（岛和Ｂ分别为空白孔和抑制孔的吸光值），ｉｃＥＵｓＡ的ＩＣ卯为１．９∥Ｌ，检测范围为０．５—７．５∥Ｌ（抑制率２０％－８０％）。表２马兜铃酸Ａ的添加回收率Ｔａｂｌｅ２ＲｅｃｏｖｅｒｙｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｅａｃｉｄＡｓｐｉｋｅｄｔｏｅａｕｌｉｓｅｌｅｍａｔｉｄｉｓａｎｎａｎｄｉｉｓａｍｐｌｅｓｂｙｉｃＥＬＩＳＡ万方数据第８期南铁贵等：中药致肾毒性成分马兜铃酸Ａ单抗制备及酶联免疫分析方法的建立３．５含马兜铃酸中药样品测定利用所建立的测定马兜铃酸Ａ的ｉｃＥＬＩＳＡ方法，测定６种中药材（表３）和５种中成药中马兜铃酸Ａ的含量。结果表明，川木通不含马兜铃酸Ａ；双香排石颗粒、龙胆泻肝丸、跌打丸、连翘败毒丸和止嗽青果丸等５种中成药均未检测到马兜铃酸Ａ；关木通、广防己中含量很低；天仙藤、马兜铃和青木香中含量较高，但是ＥＬＩＳＡ测得的马兜铃酸Ａ的含量大于ＨＰＬＣ，这与抗马兜铃酸Ａ单克隆抗体ｌＡｌｌ与马兜铃酸Ｂ、Ｃ和Ｄ的交叉反应有关，其他研究者也得到类似的结果…Ｊ。由于其它马兜铃酸类化合物同样具有毒性，本测定结果对药品安全监督具有现实意义。表３ｉｃＥＬＩＳＡ和ＨＰＩ。Ｃ测定中药材和中成药马兜铃酸Ａ含量ｉｃＥＬＩＳＡａｎｄＨＰＬＣａｎ＇，ｄｙｓｉｓｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡｉｎｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄ屿兜铃酸Ａ浓度Ａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（．ｇ／Ｌ）图３马兜铃酸Ａ的ｉｃＥＬＩＳＡ标准曲线Ｆｉｇ．３ＳｔａｎｄａｒｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡｉｎｉｃＥＵＳＡｆｏｒｍａｔＴａｂｌｅ３Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ１２ＺＨＵＤｅ－Ｑｉｕ（祝德秋），ＳＨＥＮＪｉｎ—Ｆａｎｇ（沈金芳）．ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｙ（中国药房），２００５，１６（２）：１４９—１５０ＪＬ，ＴｉｅｌｅｍａｎｓＣ，ＡｂｒａｍｏｗｉｃｚＤ，ＤｅｐｉｅｒｒｅｕｘＭ，Ｖａｎｈａｅｌｅｎ－ＦａｓｔｒｅＲ，ＶａｎｈａｅｌｅｎＭ，ＤｒａｔｗａＭ，ＲｉｃｈａｒｄＤ，ＪａｄｏｕｌＭ．Ｌａｎｃｅｔ．，１９９３。３４１（８８４２）：３８７—３９１ＶａｎｈｅｒｗｅｇｈｅｍＣ，ＶａｎｄｅｒｖｅｌｄｅＤ，Ｖｅｒｂｅｅｌｅｎ３４５ＲｅｇｉｎｓｔｅｒＦ，ＪａｄｏｕｌＭ，ｖａｎＹｐｅｒｓｅｌｅｄｅＳｔｒｉｈｏｕＣ．Ｎｅｐｈｒ０１．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９９７，１２（１）：８１～８６ＯｎｏＴ，ＥｒｉＭ，ＨｏｎｄａＧ，ＫｕｗａｈａｒａＣｏｓｙｎｓＴ．Ｌａｎｃｅｔ．，１９９８，３５１（９１０７）：９９１～９９２ＪＰ。ＪａｄｏｕｌＭ，ＳｑｕｉｆｆｌｅｔＪＰ，ＷｅｓｅＦＸ，ｖａｎＹｐｅｒｓｅｌｅｄｅＳｔｒｉｈｏｕＣ．Ａｍ．上Ｋ／ｄｎｃｙＤＩＳ．，１９９９。３３（６）：１０１１—１０１７６ＲＡＯＸ．ｉｎｇ－Ｒｏｎｇ（饶向荣），ＬＩＳｈｅｎ（李深），ＬＩＸｉｕ－Ｙｉｎｇ（李秀英），ＹＡＯＮａｉ—Ｌｉ（姚乃礼）．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ７ＬＩＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ（中国中医药信息杂志），２００１，８（２）：８２～８６Ｙｉｎｇ（李瑛）．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｌｙｓｉｓ＆Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（肾脏病与透析肾移植杂志），２００３，１２（６）：Ｃｈａｏ—Ｘｉａ（常朝霞）。ＮＥＩＧｕｉ．Ｈｕａ（聂贵华），ＣＨＥＮＨｕｉ．Ｑｉａｎｇ（陈汇强），ＺＨＡＯＸｉｎ－Ｙｉｎｇ（赵新英），ＭＥＩＰａｔｅｎｔ５５８—５６３８ＣＨＡＮＧＨｏｎｇ－Ｙｏｎｇ（梅洪勇），ＳＵＮＢａｏ—Ｍｉｎｇ（孙保明）．ＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ２２９—２３０９ＳＨＡＮＧＭｅｄｉｃｉｎｅ（中成药），２０００，２２（３）：Ｍｉｎｇ．Ｙｉｎｇ（尚明英）。ＬＩＪｕｎ（李军）。ＨｕＢｏ（胡波），ＹＡＮＧＳｈａｈ（杨珊），ＵＣｈａｎｇ—Ｌｉｎｇ（李长龄），ＺＨＥＮＧＡｎｄＨｅｒｂａｌＪｕｎ．Ｈｕａ（郑俊华）．ＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ１０ＺｈａｎｇＤｒｕｇｓ（中草药），２０００，３１（１２）：８９９－９００Ｃ，ＷａｎｇＸ，ＳｈａｎｇＭ，ＹｕＪ，ＸｕＹ，ＬｉＺ，ｋｉＬ，ＬｉＸ，ＣａｉＳ，ＮａｍｂａＴ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａ胁ｇｒ．，２∞６，２０（４）：３０９—３１８１１１２ＹｕＦＹ，ＬｉｎＹＨ，ＳｕＣＨＡＮＣ．上Ａｇ而ｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，２０嘶，５４（７）：２４９６—２５０１Ｄａｎ（韩丹），ＹＵＭｅｎｇ（予梦），ＷＵＭｅｉ（吴梅），ＤＥＮＧＡｎ—Ｐｉｎｇ（邓安平）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（分析化学），２００７，３５（８）：１１６８—１１７０１３ＵＢ０（李渡）。ＳＨＩＨａｉ—Ｙａｎ（施海燕），ＷＡＮＧＭｉｎｇ—Ｈｕａ（王鸣华）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（分析化学），２０鹏，３６（１）：３４～３８万方数据１２１０分析化学第３８卷１４ＴｉａｎＭ，ＴａｎａｋａＨ，ＳｈａｎｇＭＹ，ＫａｒａｓｈｉｍａＳ，ＣｈａｏＺ，ＷａｎｇＸ，ＧａｉＳＱ，ＳｈｏｙａｍａＹ．Ａｍ．上Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．，２００３，３ｌ（２）：１６３～１６９１５ＺｈａｏＪ，ｕｃ，ＷａｎｇＢＭ，ＬｉｕＷ，ＮａｎＴＧ，ＺｈａｉｚＸ，ＬｉｚＨ，ＬｉＱＸ．ＡｎａｌＢ／ｏａｎａ／．Ｃｈｅｍ．，２００６，３８６（６）：１７３５—１７４０１６ＺＨＵＬｉ－Ｐｉｎｇ（朱立平），ＣＨＥＮＸｕｅ—Ｑｉｎｇ（陈学清）．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｔｈｏｄｓ（免疫学常用实验方法）．Ｂｅｉｊｉｎｇ（北京）：Ｐｅｏｐｌｅｇ１７１８ＹｕａｎＰｒｅｓｓ（人民军医出版社），２０００：５２～５５Ｊ，ＮｉｅＬ，ＺｅｎｇＤ，ＬｕｏＸＢ，ＴａｎｇＦ，ＤｉｎｇＬ，ＬｉｕＱ，ＧｕｏＭＬ，ＹａｏＳＺ．Ｔｕｌｕｒａａ，２００７，７３（４）：６４４～６５０Ａ，ＪｏｎｅｓＭＢ，ＶｅｌａＮ，ＣｉｏｌｉｎｏＬＡ，ＷｏｌｎｉｃｋＫＡ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃＡｃｉｄｉｎＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉ－ＦｈｒｅｒＲｃｉｎｅｓａｎｄＤｉｅｔａｒｙＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，ｍａｒｋｅｄＤＲＡＦＴ，Ｎｏ．４２１２．Ｕ．Ｓ．ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ。ＦｏｒｅｎｓｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙＣｅｎｔｅｒ；Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ。ＯＨ：ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＳｅｎｓｉｔｉｖｅＭｏｎｏｃｉｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄＥｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙｆｏｒＲｅｎａｌＴｏｘｉｃｉｔｙＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｅａｃｉｄＡｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨｅｒｂＭｅｄｉｃｉｎｅＧａｎ９２，ＮＡＮＴｉｅ．Ｇｕｉｌ，ＨＥＳｕ．Ｐｉｎ９１，ＴＡＮＧｕｉ．Ｙｕｌ，ＬＩＷＡＮＧＢａｏ．Ｍｉｎ”．ＨＵＡＮＧＬｕ．Ｑｉ’３１（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙａｎｄ２（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，＆彬，ｌｇ１００１９３）ａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＪｉｌｉｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３）３（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００）ＡｂｓｔｒａｃｔＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ－ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｔｌｍｐｒｏｄｕｃｅｄａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎａｎｄｃｏａｔｉｎｇａｎｄａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ－ｏｖａｌｂｕｍｉｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ＯＶＡ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ｗｅｒｅａｓｔｈｅａｎｔｉｇｅｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａａｎｔｉｂｏｄｙ（ｍＡｂ），ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ１Ａ１１，ｗａｓｐｒｏｄｕｃｅｄｗｉｔｈａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ·ＢＳＡ．ｒ１１ｌｅｔｉｔｅｒＷａＳ２×１０４．Ｋ而ｅｍＡｂｗａｓＩｇＧｌｉｓｏｔｙｐｅ诵ｔｈｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｓ．Ａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ—ｂａｓｅｄｉｎｄｉｒｅｃｔｅｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍＡｂ．１１１ｅｅｎｚｙｍｅ—ｍＡｂｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ｉｃＥＵＳＡ）ｗａｓＤ，ａｎｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ（ＣＲ）ｏｆｌＡｌｌｗｉｔｈａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＢ，ＣａｎｄａｎａｌｏｇｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ，ｗａｓ２．８％，３．５％ａｎｄ３１．２％，０．５—７．５弘ｇ／Ｌ，ａｒｍａｎｄｉｉｗｅｒｅ８６％一ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＩＣ蜘ａｎｄｔｈｅｗｏｒｋｉｎｇｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｉｃＥＵＳＡｆｏｒａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡｗｅｒｅ１．９ａｎｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｎｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡｆｏｒｔｉｆｉｅｄｉｎｃａｕｌｉｓｃｌｅｍａｔｉｄｉｓ９７％ｗｉｔｈＲＳＤｏｆ５．２％一１１．１％．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂｍｅｄｉｃｉｎｅｓａｎｄＣｈｉｎｅｓｅｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙｍｅｄｉｃｉｎｅｓｗｉｔｈｉｃＥＵＳＡｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘａｍｉｎｅｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｍａｎｓｈｕｒｉａｎｈｅｒｂａａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｅ，ｆｒｕｃｔｕｓｃａｕｌｉｓｃｌｅｍａｔｉｄｉｓａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｅ，ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｄｕｔｃｈｍａｎｓｐｉｐｅｓｔｅｍ。ｗｅｒｅｗｅｒｅｆａｎｇｃｈｉ，ａｎｄｓｕｉｔａｂｌｅｄｕｔｃｈｍａｎｓｐｉｐｅｒｏｏｔｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅａｒｍａｎｄｉｉａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒＣｈｉｎｅｓｅｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙｍｅｄｉｃｉｎｅｓｅｘａｍｉｎｅｄｓａｍｐｌｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓ．１１１ｉｓＥＵＳＡｉｓＡｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨｅｒｂｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＫｅｙｗｏｒｄｓｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃａｃｉｄＡ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ；ＣｈｉｎｅｓｅＨｅｒｂｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒ－（Ｒｅｃｅｉｖｅｄ１０Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００９；ａｃｃｅｐｔｅｄ７Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１０）万方数据中药致肾毒性成分马兜铃酸A单抗制备及酶联免疫分析方法的建立
作者：作者单位：
南铁贵， 何素平， 谭桂玉， 李刚， 王保民， 黄璐琦， NAN Tie-Gui， HE Su-Ping，TAN Gui-Yu， LI Gang， WANG Bao-Min， HUANG Lu-Qi
南铁贵,何素平,谭桂玉,王保民,NAN Tie-Gui,HE Su-Ping,TAN Gui-Yu,WANG Bao-Min(中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100193)， 李刚,LI Gang(吉林省农业科学院,农业环境与资源研究中心,长春,130033)， 黄璐琦,HUANG Lu-Qi(中国中医科学院中药研究所,北京,100700)
分析化学
CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY2010,38(8)2次
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