一，简单的3步骤程序。
1.将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。
2.将带专用头的移液器插入带有电极杯的移液器座中; 在设备上选择程序，然后按开始。
3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。
注：1. 为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA / siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液 2. 为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用头超过2次
二，软件操作程序
1.按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon®设备。 本机检查确保Neon®移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。
2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。 按所需的电压值，然后按Done保存该值。 注意：如果任何输入值超出，则会显示错误信息，并自动设置最小的值。
3.按Width激活数字键盘输入宽度值。 按所需的宽度值，然后按Done保存该值。
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4. 按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。 按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。
5. 如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。
6. 按所需的程序号码编辑程序。 选定的程序会突出显示。 7. 显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。 光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width和Pulses信息。
8。按Enter键将信息保存在数据库中。
9. 继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座
三，细胞与DNA混合物准备 注意事项：
1. 将纯化的DNA重悬于1-5μg/μL浓度的去离子水或TE缓冲液（10mM TrisHCl，1mM EDTA，）中。 浓度可能因细胞类型而异。 2. DNA量不应超过使用总体积的10％。
3. 通过测量A 260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。 电穿孔的比例应至少为。
4. 该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。 使用大于20 kb的质粒很可能降低转染效率。 5. 不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。 通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。
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v1.0 可编辑可修改 6. 不含Ca2 +和Mg2 +的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页） 流程：
1. 用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和Buffer E2，100μLNeon®Tip）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。）
2. 将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。
确保Neon®管的侧面电极与Neon®移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）
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3. 在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％汇合。
4. 对于大多数优化协议，每10μLNeon®Tip可提供5×10-2×10个细胞。（5×10-2×10个细胞每100μLNeon®Tip适用于大多数优化的方案。）
5. 将含有血清，PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）和胰蛋白酶/ EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37℃。从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/ EDTA或TrypLE Express（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400×g离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400×g离心5分钟，用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）清洗细胞。吸出PBS并以×10 个细胞/ mL的最终密度将细胞沉淀重悬于Resuspension Buffer R中。 轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。 可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。
6. 通过用含有血清和补充剂的培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37℃/ 5％CO 2培养箱中预培养板。 如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。
7. 对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA
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v1.0 可编辑可修改 的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。 使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液
8. 使用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip）装入Neon®移液管 9. 根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件 10. 将适量的质粒DNA / siRNA转移到无菌的微量离心管中。 11. 将细胞加入到含有质粒DNA / siRNA的管中，轻轻混合。 请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。
12. 要将Neon®Tip插入Neon®移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具
13. 将Neon®移液器的顶部插入Neon®Tip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）
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14. 轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。 注意：确保Neon®移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接
15. 将Neon®移液器上的按钮按到第一站，并将Neon®Tip浸入细胞DNA / siRNA混合物中。 缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA / siRNA混合物吸入Neon®Tip。
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在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。 如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。
16. 将带有样品的Neon®移液器垂直插入放置在Neon®移液器站中的Neon®Tube，直至听到咔嗒声。 确保移液器突起插入吸液管的槽中。
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17. 确保Neon®移液器的金属头与Neon®移液器支架内的球形活塞和Neon®Tube（见左图所示的正确位置）紧密连接。
18. 在传送电脉冲之前，Neon®设备会自动检查Neon®Tube和Neon®Pipette是否正确插入。
19. 在电穿孔期间监测Neon®Tip，以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧（火花）。 电弧导致转染效率低，细胞活力低。 20. 交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete”以指示电穿孔完成。
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21. 从Neon®移液器站慢慢移除Neon®移液器，并立即从Neon®Tip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养基中。
22. 我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。
23. 要放弃Neon®Tip，请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。
24. 对剩余的样品重复步骤7-16。 使用两次后，请务必更换Neon®Tips，并在10次使用后更换Neon®Tubes。 每个新的质粒DNA样品使用新的Neon®Tip和Neon®Tube
25. 轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。 在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。 注意
1.如果您没有使用Neon®设备，将后面的电源开关转到OFF位置。
2. 避免在Neon®移液器台内溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。
3. 如果您不小心将任何液体（如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon®移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。倒置并允许车站在室温下完全干燥24小时。
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v1.0 可编辑可修改 优化流程
1. 确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA，并制备含有 mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。 准备足够的细胞和质粒DNA / siRNA进行至少30次转染。
2. 对于使用24孔格式的10μLNeon®Tip的每个电穿孔样品，请参见下表。 对于以24孔格式使用100μLNeon®Tip，请将下表中列出的数值适当调整10倍。
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3. 使用3 mL电解缓冲液（将缓冲液E用于10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip）置于含有细胞DNA / siRNA混合物的Neon®移液站中，如第15页所述。
4. 按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。
5. 电穿孔后，立即取出Neon®移液器，将样品从10μLNeon®Tip中转移到预热的 mL培养基中。
6. 对于100μLNeon®Tip，将稀释样品在900μL培养基中稀释10倍，并将100μL样品转移至 mL预热培养基中。
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7. 对剩余的样品重复步骤3-5。
8. 轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。 在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。
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