09生物技术（1）
一、实验目的
1.熟悉苹果酒的酿造工艺流程；
2.了解苹果原料的预处理及苹果汁防氧化方法；
3.熟悉苹果榨汁的方法、亚硫酸的使用及榨汁机的使用；
4.研究外加酶制剂辅助酶解对苹果酒酿造品质的影响；
5.掌握果酒活性干酵母的活化方法及酵母菌接种操作；
6.通过发酵过程各种参数的变化，了解苹果酒酿造的动态变化规律。
二、实验原理
果酒酿造是利用酵母菌将果汁中的糖分经酒精发酵转变为酒精等产物，再在陈、澄清过程中经醋化、氧化及沉淀等作用，使之变成酒质清晰、色泽美观、醇和芳香的产品。果酒酿造要经历酒精发酵和陈等两个阶段。在这两个阶段中发生着不同的生物化学反应，对果汁的质量起着不同的作用。
1、果酒发酵期中的生物化学变化
①酒精发酵
酒精发酵是果酒酿造过程中的主要生物化学变化。它是果汁中的己糖经果酒酵母的作用，生成酒精和二氧化碳。果酒酵母细胞含有多种酶类。如转化酶能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖；酒精酶使己糖分解成乙醇和二氧化碳；蛋白酶使蛋白质分解成氨基酸；氧化促进果酒陈，并使单宁、色素和胶体物质沉淀；还原酶能使某些唔制与氢作用起还原作用，尤其是与含硫物质作用生成硫化氢而释放。②酒精发酵过程中的其它产物
果汁经酵母菌的酒精发酵作用，除生成乙醇和二氧化碳外，还产生少量的甘油琥珀酸、醋酸和芳香成分及杂醇油等，这些都是有利于果酒的质量。
2.果酒在陈过程中的变化
刚发酵后的新酒，浑浊不清，味不醇和，缺乏芳香，不适引用，必须经过一段时间的陈，是不良物质消除或减少，同时生成新的芳香物质。陈期的变化主要有以下两个方面：
①酯化作用：果酒中醇类与酸类化合生成酯，如醋酸和乙醇化合生成清香型
的醋酸乙酯，醋酸与戊醇化合生成果香型的醋酸戊酯。
②氧化还原与沉淀作用：果酒中的单宁、色素等经氧化而沉淀，醋酸和醛类经氧化而减少，糖苷在酸性溶液中逐渐结晶下沉，以及有机酸盐、细小微粒等的下沉，也都在陈期中完成。因此经过陈，可使果汁的苦涩味减少，酒汁进一步澄清。
3.二氧化硫的作用
二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。发酵基质中二氧化硫浓度为60~100mg/L。此外，尚需考虑下述因素：原料含糖量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。
三、实验材料
1.仪器：电磁炉、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台等
2.用具：广口瓶、试管、锥形瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、纱布等
3.材料：苹果、白沙糖、亚硫酸、果胶酶、苹果酸等
四、工艺流程
（1）干酵母的活化
（2）苹果酒的生产工艺流程：异Vc
→倒瓶→补加二氧化硫→陈→调配（皂土和明胶下胶）→澄清→过滤→催熟→过滤→贮酒→成品
五、实验步骤
1.仪器器皿的准备
将所需的器皿清洗干净，置于沸水中蒸煮备用
2菌种的活化
将活性干酵母溶于配制好的豆芽汁葡萄糖培养基中进行活化，置于35-40摄氏度
水浴锅中保温活化20-30min，并不断搅拌。
3、发酵前苹果的前处理
去除苹果的杂质，然后用自来水清洗，去核，切片，榨汁。
4、苹果汁成分的调整
测量苹果汁的糖度和酸度，糖度为22%，酸度pH为4.5左右，若不符合要求加入适量白沙糖和苹果酸进行调整，每升苹果汁按60mg二氧化硫加入量计算。成分调整好后静置澄清备用。
5、果胶酶的添加
将静置了24小时左右的的苹果汁用虹吸的方法去除果渣等沉淀物，得到的苹果汁按0.02g/L果胶酶加入
6、接种及发酵
将活化好的酵母菌接入分离后的苹果汁中接种，混匀。在混匀的发酵液中取出适量的发酵液检测部分发酵原始参数如糖度、酸度、菌体数等，封闭瓶盖，在18摄氏度下自然发酵，定期进行相关参数的检测，观察果酒发酵过程中的动力学变化规律。主发酵约10天（具体时间依据参数检测的结果而定）。
7、下胶澄清
主发酵结束后，糖度降至约为7%左右，进行下胶处理。根据所得发酵液按1%的明胶4ml/100ml发酵液和10%皂土10ml/100ml发酵液加入，进行澄清处理，澄清的目的：使悬浮的胶体蛋白质凝固而生成絮状沉淀，慢慢的下沉，使酒变澄清。
8、苹果酒后发酵及陈
下胶后静置澄清一天左右，进行初次倒瓶，酒液尽量满瓶，并补加亚硫酸，按150ug/500ml酒液进行补加，封闭瓶盖进行陈。
六、实验过程与结果分析
1.实验过程记录：
2.实验分析
由图我们看到发酵液的pH值是在3.0—5.0之间，由图看出随着发酵的进行
pH总体是先增大后减小的的，实验过程可能存在一定误差。
分析原因和得出的结论：一方面是由于果胶酶分解苹果中的果胶生成果胶酸从而使得酸度增大，另一方面是由于酵母菌是兼性厌氧微生物，在发酵过程中利用还原糖产生酒精的同时也会发生厌氧代谢产生乳酸，从而使得发酵液的酸度增加，同时在产生酒精的时候也会产生大量的CO2，产生的CO2不能完全排出有一部分会溶解在发酵液中，从而使得发酵液的总酸含量增加。随着发酵的进行酵母菌消耗葡萄糖产生酒精，也使得pH值上升。
由图可以看出随着发酵的进行，还原糖的含量逐渐减少，分析原因和得出的结论：苹果酒的发酵主要是利用酵母菌消耗苹果中的还原糖产生酒精，使得还原糖的含量逐渐降低。
由图CO2的失重我们可以看出随着发酵的进行发酵液重量逐渐减轻。
分析原因和得出的结论：因为酵母菌把发酵液中的糖类等可利用的物质转化成酒精和CO2，一部分CO2会排出发酵液，酒精的密度比水小，从而使得发酵
液的重量减少。
由图看出随着发酵的进行发酵液的酵母细胞的数目开始呈递增状态，达到最大之后开始减少。
分析原因和得出的结论：酵母细胞的数目开始呈递增状态，此时的条件有利于酵母的增值，营养丰富，酵母大量繁殖，但随时间的进行酵母菌生长到一定阶段时它的代谢活动逐渐加大使得发酵液中的物质被消耗，酒精含量越来越高，营养物质被逐渐利用，抑制酵母的繁殖，并导致酵母的大量死亡。
3.实验心得与体会：
通过这次苹果酒酿造实验，巩固、扩大和加深了我们从课堂上所学的理论知识，也让我更进一步实地了解到制作苹果酒的整个过程，使我们更加熟悉了其生产工艺流程，以及在生产过程中需要注意的相关事项。同时进一步了解了苹果酒的功能性质，不仅学会了如何酿造苹果酒，而且学会了如何测定苹果酒在酿造过程中的各项指标，比如说苹果酒的糖度、酸度和酵母细胞的总数，使自己熟练的掌握了如何使用显微镜和血球计数板来测计数板上的酵母数量。这次的实验同时也使
自己能更加熟练的使用电脑处理各种数据等。
