还原糖和总糖的测定方法

一、材料、主要仪器和试剂

1、材料 小麦面粉;精密pH试纸。 2、主要仪器

(1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11 （2）大离心管：50mL×2 （3)烧杯：100mL×1 (4）三角瓶：100mL×1 (5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1;2mL×2;10mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）沸水浴

（9）离心机 （10）分光光度计 3、试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 (2）3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

（3）碘—碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾,溶于100mL蒸馏水中. （4)酚酞指示剂：称取0。1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中. （5）6MHCl和6MNaOH各100mL. 二、操作步骤

1．制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5—二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作 管号 0 1 2 3 4 5 6

1mg/mL 葡萄糖标准液

（mL）

0 0。2 0.4 0。6 0.8 1。0 1.2

蒸馏水 （mL)

2 1.8 1。6 1.4 1。2 1。0 0。8

DNS (mL） 1.5 1。5 1.5 1.5 1。5 1。5 1.5

葡萄糖含量 (mg）

0 0。2 0.4 0。6 0.8 1.0 1.2

光密度值 （OD540nm）

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温,用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管

的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2．样品中还原糖和总糖的测定 （1）还原糖的提取

准确称取3.00g食用面粉,放入100mL烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次,再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液.

（2)总糖的水解和提取

准确称取1。00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀,作为总糖待测液。 （3)显色和比色

取4支20mL具塞刻度试管，编号,按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管.加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

表2样品还原糖测定 管号 7 8 9

还原糖待测液 （mL）

0。5 0.5

光密度值 总糖待测液 蒸馏水 DNS 查曲线葡萄糖量

（mL） (mL） （mL） （OD540nm） （mg） 1 1

1。5 1。5 1 1

1.5 1.5 1.5

10

三、结果与计算:

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。