青蒿琥酯配伍螺旋藻多糖抗肝癌SMMC—7721细胞活性作用研究
目的：研究青蒿琥酯（artesunate，ART）配伍螺旋藻多糖（polysacchride from spriulina，PSP）對肝癌SMMC-7721细胞株的抑制作用。方法：MTT法分别测定ART、PSP、ART与PSP配伍对肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用，ELISA方法研究凋亡蛋白Caspase-3的活性。结果：ART在体外可明显抑制SMMC-7721细胞的增殖，在24 h、48 h、72 h的IC50值分别为45.2 μg/ml、34.7μg/ml、22.1μg/ml；
PSP对肿瘤SMMC-7721的抑制作用稍弱，在24 h、48 h、72 h的IC50分别为157.4 g/ml、140.3 g/ml、110.0 μg/ml；当ART（12.5 μg/ml、
25.0 μg/ml、50.0 μg/ml）与PSP（90 μg/ml）配伍使用时，显示出较强的抗瘤作用；ART与PSP配伍作用细胞后，ELISA方法检测到酶Caspase-3的活性增强。结论：ART与PSP配伍使用时对肝癌SMMC-7721细胞的增殖有明显的抑制作用，其作用途径可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡。
标签： 青蒿琥酯； 螺旋藻多糖； 抗肿瘤
青蒿琥酯是青蒿素（artemisinin）的一种重要衍生物，近年来就其在抗肿瘤方面的研究是一热点[1-4]。在前期对青蒿琥酯和螺旋藻多糖单体分别研究的基础上，观察青蒿琥酯配伍螺旋藻多糖对肝癌细胞的抑制作用，现将结果报道如下。
1 材料
1.1 药品与试剂
青蒿琥酯购于桂林制药厂，螺旋藻多糖购于广西北海绿A螺旋藻公司（进一步纯化由广西医科大学基础医学院实验中心贾晓栋讲师完成，纯度达92.05%），SMMC-7721细胞株购于中科院上海细胞库，RPMI-10培养液（美国Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物公司），四唑盐（MTT）购自Sigma公司，Caspase-3检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。
1.2 实验仪器
全自动CO2孵箱（Thermo Formo），倒置显微镜（日产），酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司）。
2 方法
2.1 细胞培养
SMMC-7721置于含10%胎牛血清的RPMI -10培养液，37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞长至约80%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生
长期细胞用于实验。
2.2 ART对肿瘤细胞的抑制率
取对数生长期的SMMC-7721细胞，按每孔细胞（3～5）×103个，190 μl接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，待细胞贴壁后加入各组药物，ART终浓度梯度为25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml，37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养24 h、48 h、72 h，OD值测量波长为双波长570/630 nm，以下列公式计算抑制率：抑制率=（1-加药组OD/对照组OD）×100%。
2.3 PSP对肿瘤细胞的抑制率
方法同2.2，PSP终浓度分别为45 μg/ml、90 μg/ml、180 μg/ml作用肿瘤细胞24 h、48 h、72 h后计算抑制率。
2.4 ART与PSP配伍使用对肿瘤细胞的抑制率
方法同2.2，将ART终浓度分别为12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml与PSP浓度为90 μg/ml配伍作用肿瘤细胞48 h、72 h后计算抑制率。
2.5 Caspase-3活性的研究
ART与PSP配伍作用SMMC-7721细胞48 h后收集细胞，每2×106个细胞的比例加100 μl裂解液、冰浴、离心，收集上清，测试各样品孔中OD值，根据标准曲线方程求得相应样品孔中Caspase-3活性。
3 结果
3.1 ART对SMMC-7721细胞的抑制率和IC50值
ART不同浓度对细胞的抑制率得出后，用Bliss法计算出ART作用24 h、48 h、72 h的IC50分别为45.2 μg/ml、34.7 μg/ml、
22.1 μg/ml。见表1。
3.2 PSP对SMMC-7721细胞的抑制率和IC50值
PSP不同浓度对细胞的抑制率得出后，用Bliss法计算出PSP作用24 h、48 h、72 h的IC50分别为157.4 μg/ml、140.3 μg/ml、110.0 μg/ml。见表2。
3.3 ART与PSP联合使用
ART与PSP配伍作用肿瘤细胞48 h、72 h后，12.5 μg/ml、25.0 μg/ml的ART与90.0 μg/ml的PSP对肿瘤SSMC-7721细胞的抑制率最高可达75.0%，配伍使
用显示出很好的抗瘤效应。见表3。
3.4 Caspase-3活性变化
ART与PSP联合作用于SMMC-7721细胞48 h后，根据OD值由拟合的标准曲线求得相应样品空中Caspase-3的浓度（48 h）。与空白组比较，配伍作用细胞48 h，细胞中Caspase-3浓度高于对照组。见表4。
4 讨论
ART是从中药青蒿中提取的活性成分，螺旋藻多糖是一种从我国海南、广西等省区盛产的螺旋藻中提取的水溶性多糖化合物，课题组成员前期已对其抗瘤作用开展了一定研究[1，5]。在前期基础上，尝试ART与PSP配伍使用对肝癌SMMC-7721细胞的抗瘤作用。结果显示，ART对肝癌SMMC-7721有明显的抑制作用，对肝癌SMMC-7721的24 h、48 h、72 h的IC50分别为45.2 μg/ml、34.7 μg/ml、22.1 μg/ml，呈现一定的剂量效应关系；PSP对肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用稍弱，在较高浓度200 μg/ml时才显示出明显的抑制作用，在24 h、48 h、72 h的IC50分别为157.4 μg/ml、140.3 μg/ml、110 μg/ml；但将ART与PSP终浓度为90 μg/ml配伍使用时，对肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用显著增强，这为研究抗肿瘤活性成分提供了一个新的思路。目前我国已对3000种以上的中草药进行了抗肿瘤筛选，发现其中有200种左右具有抗肿瘤活性[6]，其中存在的一个问题是有些中药单体单独使用抗瘤活性不如目前临床使用的化疗药物那么强大，如何将中药单体开发为临床上可广泛应用的药物，笔者认为将多种中药单体合理配伍成复方制剂研究其抗瘤作用，一方面可解决中药单体自身抗瘤活性不够强的问题，另一方面多种中药单体抗瘤作用途径不一，复方制剂可以从多途径、多位点起到抗瘤作用，甚至可以起到抑制肿瘤细胞耐药等，因此，研究开发具有抗瘤作用的不同中药单体配伍的复方制剂对于研发抗肿瘤中药具有重要意义。
Caspase家族成员中Caspase-3为是细胞凋亡的关键执行分子，研究Caspase-3的活性对于细胞凋亡具有重要意义[6]。抗瘤作用稍弱的PSP与ART配伍作用细胞48 h后，检测到肿瘤细胞内蛋白Caspase-3活性明显增高，初步说明ART与PSP配伍使用可能通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的增殖，但两者是作为配伍使用，两者具体的抗瘤机理还需系统深入的研究，下一步研究中药复方抗肿瘤制剂将是我们课题组努力尝试的一个方向。
参考文献
[1]陈永顺，李静，杨斌，等.青蒿琥酯对肝癌HEPG-2细胞Caspase-3和P53蛋白的影响实验研究[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1603-1604.
[2]金美华，沈雪松，赵春霞，等.青蒿琥酯纳米脂质体抗肝癌作用及其与肝脏中药物含量关系研究[J].时珍国医国药，2012，23（7）：17-19.
[3]黄伟炜，刘宁，牛红军，等.青蒿琥酯对人结肠癌细胞HCT-8细胞凋亡和细胞周期的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：225-228.
[4]柳佳利，王珣，杨亚萍，等.原子力显微镜观察青蒿琥酯对人胃癌细胞株SGC-7901膜表面形貌的影响[J].中国病理生理杂志，2012，28（6）：974-979.
[5]贾晓栋，邝晓聪，庞辉，等.螺旋藻多糖对肝癌细胞BEL741M增殖的影响[J].广西医学，2008，30（8）：1122-1124.
[6]史清文，李力更，霍长虹，等.天然药物化学研究与新药开发[J].中草药，2010，41（10）：1583-15.
