第２７卷第６期 ２０１５年６月 化学研究与应用 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．６ Ｊｕｎｅ，２０１５ 文章编号：．１００４—１６５６（２０１５）０６－０８１５－０７ 荧光光谱法研究亚甲蓝与三种 芳香族氨基酸的相互作用 朱燕舞 ，赖彭亮，吴笑笑，周洁梅，江 欢，王均胜，邓 宁，何建波 （合肥工业大学化学与化工学院，可控化学与材料化工安徽省重点实验室，安徽合肥２３０００９） 摘要：本文运用荧光光谱法研究亚甲蓝（ＭＢ）分别与色氨酸（Ｔｒｐ）、酪氨酸（Ｔｙｒ）和苯丙氨酸（Ｐｈｅ）三种芳香族 氨基酸的相互作用。在ｐＨ ７．４ ｓ－ＨＣＩ缓冲溶液中，ＭＢ引起上述三种氨基酸明显的荧光猝灭现象，最大荧 光猝灭波长分别位于３４６、３０３和２８２ｎｍ。其荧光猝灭值（ 一Ｆ）在一定范围内与ＭＢ成正比，用于测定ＭＢ具 有高灵敏度。通过Ｓｔｅｒｎ．Ｖｏｌｍｅｒ作图及温度的影响，表明ＭＢ与三种芳香族氨基酸之间以摩尔比１：１形成基 态复合物，均产生显著的静态猝灭，相互作用力较强，其中ＭＢ主要通过疏水作用与Ｔｒｐ结合，与Ｔｙｒ和Ｐｈｅ之 间的结合过程以静电作用力为主。 关键词：亚甲蓝；色氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸；荧光猝灭 中图分类号：０６５７．３ 文献标志码：Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ＺＨＵ Ｙａｎ・ＷＵ’，ＩＡＩ Ｐｅｎｇ—ｌｉａｎｇ，ＷＵ Ｘｉａｏ—ｘｉａｏ，ＺＨＯＵ Ｊｉｅ—ｍｅｉ，ＪＩＡＮＧ Ｈｕａｎ， Ｗａｎｇ Ｊｕｎ—ｓｈｅｎｇ，Ｄｅｎｇ Ｎｉｎｇ，ＨＥ Ｊｉａｎ—ｂｏ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｆｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ＆Ｍａｔｅｒｉｌａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｆｅｉ ２３０００９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ（ＵＭＢ）ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ＴＯ），ｔｙｒｏｓｉｎｅ（ ）ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｐｈｅ）ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＭＢ ｃｏｕｌｄ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｑｕｅｎｃｈ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ ７．４），ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ ｗｅｒｅ ａｔ ３４６，３０３ ａｎｄ ２８２ ｎｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ－ ｌｙ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｖａｌｕｅ（Ｆｏ－Ｆ）ｗａｓ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＢ ｉｎ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｒａｎｇｅ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＢ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｔｅｍ－Ｖｏｌｍｅｒ ｐｌｏｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｔａｔｉｃ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ＭＢ ｗｉｔｈ ｅａｃｈ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎ ａ ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ ｏｆ １：１，ａｎｄ ＭＢ ｈａｄ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＭＢ ｗｉｔｈ Ｔｒｐ，ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｔｉｃ ｅｌｅｃｔｉｒｃｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｐｌａｙ ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｅｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＢ ｉｔｗｈ Ｔｙｒ ａｎｄ Ｐｈｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ；ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ；ｔｙｒｏｓｉｎｅ；ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ 亚甲蓝（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ，简称ＭＢ，其结构式如 图１），即３，７一双（二甲氨基）吩噻嗪一５一翁氯化物， 收稿日期：２０１４－０９－３０；修回日期：２０１４－１２－０１ 基金项目：安徽省自然科学基金项目（１２０８０８５ＱＢ２９）资助；国家自然科学基金项目（２１１０２０３０）资助；合肥工业大学博士后基金项目资助 联系人简介：朱燕舞（１９７７－），女，副教授，博士，主要从事光学分析。Ｅ・ｍａｉｌ：ｙａｎｗｕｚｈｕ＠ｓｉｎ＆ｅｄｕ．ＣＩ１ ８１６ 化学研究与应用 第２７卷 是一种常见的吩噻嗪类药物，其与蛋白质具有很 隆抗体与卟啉的相互作用；基于蛋白质中色氨酸 好的亲和力，可以改变药物在生物体内的分配和 具有的内源性荧光获得牛血清白蛋白的构象变化 代谢¨ 。其可用作癌症光化学治疗剂、起到协同 过程 ；三种芳香族氨基酸可用作荧光探针测定 抗肿瘤作用 ，以及肿瘤染色标记 等；另外，亚 一些小分子物质¨ ］。目前，测定氨基酸的方法 甲蓝对细胞具有明显的解毒功效，在镇痛、抗菌、 主要有色谱法¨引、氨基酸自动分析仪法¨ 、荧光 抗病毒等方面也有明确的治疗作用。因此研究亚 法 ・ 等。 甲蓝的药理作用是十分有意义的工作。目前，痕 利用荧光光谱法研究药物小分子与芳香族氨 量亚甲蓝的测定方法主要有色谱法、分光光度法 基酸的相互作用已有阐述¨ 他，竹 ，开展药物与氨 和荧光法 ’ ，荧光光谱法具有高灵敏度、高选择 基酸的相互作用研究，有助于深入了解药物作用 性及低检测限等优点，广泛用于痕量荧光物质的 机制及在体内运输、代谢过程，而且对于新型药物 测量及荧光类物质的相互作用研究。 的设计具有重要的指导作用。 色氨酸（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，简称Ｔｒｐ）、酪氨酸（Ｔｙｒｏ— 本文基于Ｔｒｐ、Ｔｙｒ和Ｐｈｅ的内源性荧光，采用 ｓｉｎｅ，简称Ｔｙｒ）及苯丙氨酸（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，简称 荧光光谱法研究ＭＢ与Ｔｒ０、Ｙｙｒ和Ｐｈｅ的相互作 Ｐｈｅ）是三种芳香族氨基酸，是构成蛋白质和多肽 用。分析亚甲蓝与三种芳香族氨基酸荧光光谱， 的主要物质，是生物体中不可缺少的营养成分之 探讨荧光作用机理，获得二者相互作用的表观结 一。这三种氨基酸具有荧光，也是蛋白质天然荧 合常数和结合位点，从而确定相互作用力。为临 光的主要来源，其具有广泛的用途。赵大庆等 床诊断、食品营养价值评价及药物分子设计等提 利用色氨酸和酪氨酸的特征荧光光谱，研究单克 供理论基础。 Ｈ，Ｃ ＨＣＯＯＨ Ｉ ＮＨ， ＭＢ Ｈ，Ｃ ＨＣＯｏＨ ＣＯＯＨ Ｈｏ ｌ ＮＨ， 图ｌ 亚甲蓝、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸结构式 Ｆｉｇ．１ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ｔｙｒｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌａｎｉｎｅ Ｉ．２实验方法 １ 实验部分 １．２．Ｉ溶液配制配制浓度为２×１０一ｔｏｏｌ・Ｌ 的 ＭＢ储备液；Ｔｒ１）、Ｔｙｒ和Ｐｈｅ储备液的浓度分别为２ １．１仪器与试剂 ×１０～ｍｏｌ・Ｌ～、２ｘ１０一ｔｏｏｌ・Ｌ 和２ｘ１０～ｔｏｏｌ・Ｌ （２ Ｆ－２７００型荧光分光光度计（Ｈｉｔａｃｈｉ公司，日 ｘｌＯ—ｍ０１．Ｌ～、２ｘｌＯ—ｔｏｏ１．Ｌ 和２×１０～ｔｏｏｌ・Ｌ ）； 本），ＰＨＳ一３Ｅ ｐＨ计（上海雷磁精密科学仪器有限 配制０．０２ｍｏｌ・Ｌ 的ｐＨ ７．４ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液（含 公司），ＪＫ一２２００Ｂ型超声波清洗器，１８１０一Ｂ型石英 ０．１ｔｏｏｌ・Ｌ 的ＮａＣ１以恒定的溶液离子强度）。光 超纯水蒸馏器，ＴＨＺ．８２型数显水浴恒温振荡器。 谱测定所需溶液均使用缓冲溶液稀释、定容。 亚甲蓝、Ｌ一色氨酸、Ｌ．酪氨酸、Ｌ．苯丙氨酸和三 １．２．２荧光光谱测定分别恒定温度在２９８．１５Ｋ 羟甲基甲烷（Ｔｒｉｓ碱）均为生化级（ＢＲ）试剂，其余 试剂均为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有 和３１０．１５Ｋ条件下，按实验需要，准确移取一定量 限公司，二次蒸馏水为实验室自制。 的ＭＢ和各氨基酸标准溶液于ｌＯｍＬ容量瓶，用 ｐＨ７．４的Ｔｒｉｓ ＨＣＩ缓冲溶液定容，水浴恒温振荡 １ｈ，然后冷却至室温，置于１ｃｍ的石英比色皿中， 第６期 朱燕舞，等：荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用致Ｔｒｐ和Ｔｙｒ发生荧光猝灭现象。 ８１７ 设置荧光光谱仪的激发和发射光栅狭缝均为 ５ｒｉｍ，光电倍增管电压为７００ｍＶ，扫描速度为 ３００ｎｍ・ｍｉｎ～，在此条件下记录２８０ｎｍ～５５０ｎｍ范 在类似的实验条件下，固定Ｐｈｅ浓度，依次递 增ＭＢ浓度，设定Ｐｈｅ激发波长为２６０ｎｍ，测定获 得２９８．１５Ｋ（如图３ａ所示）和３１０．１５Ｋ（如图３ｂ所 示）ＭＢ—Ｐｈｅ的荧光光谱。结果显示ＭＢ对Ｐｈｅ的 作用与ＭＢ—Ｔｒｐ及ＭＢ—Ｔｙｒ类似，发生荧光猝灭作 用。Ｐｈｅ的最大荧光发射波长为２８２ｎｍ，随着ＭＢ 浓度增加，Ｐｈｅ的荧光峰形基本保持不变，ＭＢ—Ｐｈｅ 荧光峰蓝移约３ｎｍ，说明ＭＢ与Ｐｈｅ之间相互作用 而导致Ｐｈｅ荧光猝灭。ＭＢ与三种氨基酸的相互 围内的荧光光谱。 ２结果与讨论 ２．１ 亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的荧光猝灭光 谱 分别固定Ｔｒｐ和Ｔｙｒ浓度，依次递增ＭＢ浓 度，设置Ｔｒｐ和Ｔｙｒ激发波长为２７７和２７３ｎｍ，在 作用可能造成氨基酸的荧光发色团微环境及分子 构象行为变化，从而发生荧光猝灭。 实验条件下，分别测定２９８．１５Ｋ和３１０．１５Ｋ时ＭＢ 与Ｔｒｐ以及ＭＢ与Ｔｙｒ相互作用荧光光谱（如图２ 所示）。由图２可见，Ｔｒｐ和Ｔｙｒ最大荧光发射波 长分别为３４６和３０３ｎｍ，随着ＭＢ浓度递增，Ｔｒｐ和 图２和图３的插图为荧光猝灭值（ — ）对 ｃＭＢ（２ｘ１０～一２．３×１０～ｍｏｌ・Ｌ ）的线性拟合曲线， 其中 和Ｆ分别表示不加入和加入ＭＢ的荧光 强度。相应回归方程的相关系数均在０．９９以上， Ｔｙｒ荧光强度均逐渐降低，荧光光谱峰形保持不 变，ＭＢ—Ｔｒｐ最大吸收位置红移约３ｎｍ，而ＭＢ．Ｔｙｒ 红移约５ｎｍ。表明随着ＭＢ浓度增加，Ｔｒｐ和Ｔｙｒ 所处环境疏水性降低，亲水性增强。以上实验结 呈现很好的线性相关性，表明该法可用于痕量ＭＢ 的测定。其中ＭＢ—Ｔｒｐ在２９８．１５Ｋ时荧光猝灭线 性回归方程为Ｆ０一Ｆ＝５２３．１＋１．６１０ｘ１０ ｃＭＢ。 果说明ＭＢ与Ｔｒｐ以及ＭＢ与Ｔｙｒ发生相互作用导 九 ／ｎｍ ／ｎｍ ３００ ３３０ ３６０ 九 ／ｎｍ ／ｎｍ 图２ ＭＢ与ＴｒＰ和Ｔｙｒ相互作用的荧光猝灭光谱图 Ｆｉｇ．２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＢ ｗｉｔｈ Ｔｒｐ ａｎｄ Ｔｙｒ 。 ＝２ｘｌＯ—ｌｒｌ。１－ ；。 ＝３ｘ１０～ｍ。ｌ・ ；ＣＭＢ／ＩＯ～ｍ。１・ ｆｒｏｍ ０ ｔ。１１：０２１，０．４２，０．６３，０．８３，１．０，１．３，１．５，１．７， ．１・９，２・１，２・３；００：ｂｌａｎｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；（ａ）：２９８．１５Ｋ；（ｂ）：３１０．１５Ｋ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｆ０一Ｆ ａｎｄ ｃ ８ｌ８ 化学研究与应用 第２７卷 ６ ６００ 昌４ 三 ２ 虽４０Ｏ § 三 ２００ ３００ 。 ３３０ ／ｎｍ 九 ／ｎｍ 图３ ＭＢ与Ｐｈｅ相互作用的荧光猝灭光谱图 Ｆｉｇ．３ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＢ ａｎｄ Ｐｈｅ ｃＰｈ。＝５ｘ１０一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 ；ｃ（ＭＢ）／１０一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 Ｆｒｏｍ ０ ｔｏ １Ｉ：０．２０，０．４０，０．６０，０．８０，１．０，１．２，１．４， １．６，１．８，２．０，２．２；００：ｂｌａｎｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；（ａ）：２９８．１５Ｋ；（ｂ）：３１０．１５Ｋ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ —Ｆ ａｎｄ ｃ ２．２亚甲蓝对三种芳香族氨基酸的荧光猝灭机理 分子平均寿命。 根据式（１）绘制三种氨基酸分别在２９８．１５Ｋ 荧光猝灭是溶液中猝灭体分子和荧光物质分 子之间发生相互作用，使荧光物质的荧光量子效 和３１０．１５Ｋ下的（ ／Ｆ一１）～Ｃ的线性拟合曲线 （如图４所示）。结果显示，ＭＢ—Ｔｒｐ、ＭＢ Ｔｙｒ和 率降低或激发态寿命缩短，从而导致荧光强度降 低的现象 ｊ。荧光强度降低分为：动态猝灭和静 态猝灭。动态猝灭是指猝灭剂与荧光物质的激发 态分子之间所发生的与扩散有关的相互作用过 程；静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时 生成不发光的配合物，从而导致荧光强度降低的 过程¨ 。与动态猝灭相比，荧光静态猝灭受反应 温度影响较小。 ＭＢ．Ｐｈｅ作用过程中，随着温度升高Ｋ 减小，说明 升高温度可能降低了复合物的稳定性，从而使猝 灭常数下降，由此推断ＭＢ对Ｔｒｐ、Ｔｙｒ和Ｐｈｅ均为 静态猝灭作用 ］。 Ｔｒｐ、Ｔｙｒ和Ｐｈｅ的荧光寿命分别为３．１×１０ ｓ、３．６ｘ１０一ｓ和６．８ｘｌ０一ｓ＿１。ｊ，根据式（１），由Ｋ 值 计算得到 值及各线性回归方程相关系数ＪＲ ，结 果列于表１。表明，ＭＢ与上述三种氨基酸的线性 假设ＭＢ对三种氨基酸发生的是动态猝灭， 其应遵循Ｓｔｅｍ．Ｖｏｌｍｅｒ方程¨ ／Ｆ一１＝Ｋ ｃ＝Ｋｑｒ０ｃ （１） 拟合程度较好，且得到的 值均在１０”数量级以 上，远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散 式中， 和Ｆ分别表示不存在和存在猝灭剂 的荧光强度；ｃ为猝灭剂浓度，Ｋ 为动态Ｓｔｅｒｎ— Ｖｏｌｍｅｒ猝灭常数，Ｋ是由扩散过程控制的双分子 动态猝灭速率常数，７Ｉｎ为没有猝灭剂存在下荧光 猝灭常数２×１０ｍＬ・ｍｏｌ～・ｓ～，由此推断其荧光猝 灭机制是由于ＭＢ与三种芳香族氨基酸均形成基 态复合物而导致的静态猝灭过程，而非由扩散过 程控制的动态猝灭过程 。 ０ ５ ｌ０ ｌ ５ ２０ ２５ ０ ５ １０ ｌ ５ ２０ ２５ ０ ５ ｌ０ Ｉ５ ２０ ２５ １ ０ ｍＯＩ．Ｌ。’ １ ０”Ｃ ｍｏｌ Ｌ。’ １ ０“ｃ Ｉｌ１ｏＩ Ｌ ’ 图４在２９８．１５Ｋ和３１０．１５Ｋ下ＭＢ与三种氨基酸相互作用的 ／Ｆ一１对１０ ｃ图 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ Ｆ０／Ｆ一１ ａｇａｉｎｓｔ １０ ｃ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＢ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｔ ２９８．１５Ｋ ａｎｄ ３１０．１５Ｋ （ａ）：。 ＝２ｘ１０～ｍｏｌ・Ｌ～；（ｂ）：ｃＴｙｒ＝３ｘ１０～ｍ。ｌ・Ｌ～；（ｃ）：ｃ‰＝５ｘｌＯ～ｍ０ｌ・ ，ｃｍ＝（０．２～２．２）／１０～ｍ。ｌ・ 第６期 朱燕舞，等：荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用８１９ 表１ 在不同温度下ＭＢ与三种氨基酸相互作用的Ｓｔｅｍ—Ｖｏｌｍｅｒ猝灭常数 Ｔａｂｌｅ ｌ Ｓｔｅｍ．Ｖｏｌｍｅｒ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＢ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ２．３亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的表观结合常 ｌｇ［（Ｆｏ—Ｆ）／Ｆ］＝ｌｇ Ｋｃ＋ｎｌｇｃ （２） 数 与结合位点数ｎ 在２９８．１５Ｋ和３１０．１５Ｋ下分别作ＭＢ与三种 小分子间结合的表观结合常数 和结合位点 氨基酸作用的ｌｇ［（Ｆ０－Ｆ）／Ｆ］～ｌｇｃ的双对数图， 数ｎ可由式（２）求出 。 如图５所示。 ０ Ｏ ０ ｏ ＼ ，＿、 ０ ０ ●‘Ｏ 一 ．０ 一一－ｏ ．０ ．一１ ０ —５ ８—５ ６．５ ４—５ ２—５ ｏ一４ ８－４ ６ ．５ ４ －５ ２ ．５ ０ －４ ８ －４ ６ Ｉｇｃ ｌｇｃ 图５ ＭＢ与三种氨基酸相互作用的双对数图 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｌｇ［（ －Ｆ）／Ｆ］ａｇａｉｎｓｔ ｌｇｅ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＭＢ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ Ａ：２９８．１５Ｋ；ｂ：３１０．１５Ｋ；ｃｖ，ｖ＝２ｘ１０～ｔｏｏｌ・Ｌ～，ＣＴｙｒ＝３ｘ１０一ｍｏｌ・Ｌ～，ｃＰｈｃ＝５ｘ１０～ｔｏｏｌ・Ｌ～，ＣＭＢ＝（Ｉ．９７９－２１．７７）／１０～ｍｏｌ・Ｌ一’ 由图５线性拟合的截距和斜率，分别获得两 衡常数 值的数量级均在１Ｏ 以上，表明ＭＢ与 温度下的Ｋｃ、ｎ和线性回归系数尺：，结果见表２。 Ｔｒｐ、Ｔｙｒ和Ｐｈｅ之间有较强的结合作用，其结合能 表２ ＭＢ与三种氨基酸的键合常数 力为：ＭＢ—Ｐｈｅ＞ＭＢ—Ｔｙｒ＞ＭＢ－Ｔｒｐ（２９８．１５Ｋ），ＭＢ— Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ ＭＢ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ Ｔｙｒ＞ＭＢ—Ｔｒｐ＞ＭＢ—Ｐｈｅ（３１０．１５Ｋ）；（３）从不同物质 在不同温度下的结合常数 值变化中可知，温度 对ＭＢ与这三种氨基酸的结合有一定的影响。 ２．４亚甲蓝与三种芳香族氨基酸相互作用力类 型的确定 药物和生物分子之间的相互作用力主要包括 氢键、范德华力、静电作用和疏水作用等。本文在 ２９８．１５Ｋ和３１０．１５Ｋ下，基于范特霍夫方程计算 各方程的线性相关系数均在０．９９以上，线性 相应的热力学参数 ，研究ＭＢ与三种芳香族氨 相关性很好，由表２可得出以下结论：（１）ＭＢ与三 基酸之间的相互作用力。由于△ Ⅳ 随温度变化很 种芳香族氨基酸的摩尔结合比ｎ接近１：１，表明 小，故将△， 近似为常数，由式（３）～式（５）计算 ＭＢ分子与氨基酸分子体积较为接近，一分子亚甲 ＭＢ与三种芳香族氨基酸结合的热力学参数△， 蓝基本是与一分子氨基酸结合；（２）相应的结合平 、△，Ｇ 和△ ．ｓ ，结果列于表３。 ８２０ 化学研究与应用 第２７卷 △，Ｇ ＝一ＲＴｌｎＫ￣ （３） ｍ・ｎ Ｔｌ筹＝ （ Ｉ一一 ） Ｊ （４） ＝ （５） 表３ ＭＢ与三种芳香族氨基酸结合的热力学常数 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ＭＢ—ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ’ｃｅｄｕｒｅ 基于ＭＢ与三种芳香族氨基酸的结合常数 及各热力学参数，由表３可看出：（Ｉ）ＭＢ Ｔｒｐ反应 过程中△， ＞０，为吸热反应，升高温度有利于复 合物的生成，所以升高温度使结合常数增大，复合 物稳定性增强；（２）ＭＢ—Ｔｙｒ和ＭＢ．Ｐｈｅ结合过程的 △ ＜Ｏ，反应为放热反应，升高温度将不利于向着 生成复合物的方向进行，故结合常数减小，生成复 合物稳定性下降；（３）ＭＢ与三种芳香族氨基酸结 合的Ａ Ｇ ＜０，表明结合过程均是自发分子作用过 程；（４）根据药物分子与生物大分子作用的有关热 力学参数可以简单判定其相互作用类型¨ ．２４∞］。 参考文献： ［１］易平贵，刘俊峰，商志才，等．荧光光谱法研究亚甲基蓝 与蛋白质的结合反应［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００１，２１ （６）：８２６—８２８． ［２］Ｈｕ Ｙａｎｊｕｎ，Ｌｉｕ Ｙｉ，Ｚｈａｏ Ｒｕｍｉｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ ａｎｄ ｂｏ— ｖｉｎｅ Ｓｅｌ＇ｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ［Ｊ］．．，Ｐｈｏｔｏｃｈ Ｐｈｏｔｏｂｉｏ Ａ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００６，１７９（３）：３２４—３２９． ［３］孙红霞，向俊锋，张亚周，等．光谱法研究Ｇ一四链体与 亚甲蓝的相互作用［Ｊ］．科学通报，２００６，５１（９）：１０２２— １０２６． ［４］朱春雷，张朝东，王运杰．亚甲蓝对ｃ６细胞的促凋亡作 用及其与ＢＣＮＵ协同抗肿瘤作用的研究［Ｊ］．２００４，２４ （１）：２１—２４． ［５］Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ Ｈ，Ｓａｒｎｓｅｔ Ｅ．［ｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｍａｇｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｙｅ ｍａｒｋｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｗｌｑＳ［Ｊ］．Ｍｉｎｉｍ ∞ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ， 熵增加是ＭＢ与三种芳香族氨基酸分子自发作用 中主要的驱动力。在ＭＢ—Ｔｒｐ作用过程中，△，Ｇ ＜ ０，Ａ， ＞０，△，Ｓ ＞０，从热力学角度看，ＭＢ主要通 过疏水作用与Ｔｒｐ发生结合反应；在ＭＢ．Ｔｙｒ和 ＭＢ—Ｐｈｅ结合过程中，△，Ｇ ＜Ｏ，△， ＜０，△，Ｓ ＞０，表 明它们之间的相互作用主要是静电作用力。 ３ 结论 应用荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨 基酸之间的相互作用。基于Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ方程获 得动态Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ猝灭常数 。 和由扩散过程控 制的双分子动态猝灭速率常数Ｋ。随着温度升 高，Ｋ 值降低；且 值均在ｌ０ 数量级以上，两方 面结果都表明ＭＢ与三种芳香族氨基酸因形成基 态复合物而产生静态猝灭。 ＭＢ与三种芳香族氨基酸在２９８．１５Ｋ和 ３１０．１５Ｋ两个温度下形成的表观结合常数 均在 １０ 以上，结合位点 均接近１：１，表明ＭＢ与各氨 基酸结合摩尔比为１：１且相互之间作用力较强。 结合荧光光谱数据获得相互作用的热力学常数， 各Ｇｉｂｂｓ函数值均小于零，说明ＭＢ与三种氨基酸 之间是自发作用过程，其中ＭＢ—Ｔｒｐ之间主要靠疏 水作用力结合，而ＭＢ—Ｔｙｒ和ＭＢ－Ｐｈｅ结合过程以 静电作用力为主。 １９９９，４２（３）：１２３－１２７． ［６］张书然，胡蓉，杨琼，等．亚甲蓝和天青Ａ与ＡｕＣ１ 一离 子缔合物的溶剂萃取导数一同步光度法同时测定［Ｊ］． 应用化学，２００９，２６（７）：８１１－８１５． ［７］杨冬季，石文兵，刘绍璞．［ＭｅＣＩ 一］型配阴离子・亚甲蓝 离子缔合物的溶剂萃取和荧光法测定痕量亚甲蓝［Ｊ］． 高等学校化学学报，２００８，２９（４）：７２０－７２５． ［８］祁超，李伟国，张玉静，等．用荧光光谱和紫外・可见差 谱研究抗体一卟啉的相互作用［Ｊ］．高等学校化学学报， ２００２，２３（８）：１４５３－１４５６． ［９］晋可，张家兴，尹宗宁．用荧光参数表征牛血清白蛋白 溶液的构象变化过程［Ｊ］．中国药学杂志，２０１３，４８ （７）：５３１－５３６． ［１Ｏ］江珊珊，刘忠芳，胡小莉，等．’某些芳香族氨基酸作探 针荧光猝灭法测定秋水仙碱［Ｊ］．化学学报，２０１０，６８ 第６期 朱燕舞，等：荧光光谱法研究亚甲蓝与三种芳香族氨基酸的相互作用８２１ （２２）：２３２５－２３３０． ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＮＣＰ－（４一ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎｓ）ａｎｄ ｂｏ— ［１１］甘晓娟，刘绍璞，刘忠芳，等．某些芳香族氨基酸作探 ｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］． 针荧光猝灭法测定安乃近及其代谢产物［Ｊ］．化学学 Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔｓ Ａ，２０１２，９１：１ １３—１ １７． 报，２０１２，７０（１）：５８ ． 、 ［２０］Ｍｏｒｅ Ｖ Ｒ，Ａｎｂｈｕｌｅ Ｐ Ｖ，Ｌｅｅ Ｓ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ［１２］江欢，朱燕舞，王燕，等．７・羟基香豆素与三种芳香族 ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｆｌａ— 氨基酸作用的荧光光谱研究［Ｊ］．光谱学与光谱分析， ｖｉｎｅ ｈｅｍｉｓｕＩｐｈａｔｅ［Ｊ］．Ｊ Ｈｕｏｒｅｓｃ，２０１１，２１（４）：１７８９— ２０１３，３３（８）：２１１７・２１２２． １７９６． ［１３］杨苞梅，姚丽贤，国彬，等．不同品种荔枝果实游离氨 ［２１］尚永辉，李华，孙家娟，等．核黄素与牛血清白蛋白相 基酸分析［Ｊ］．食品科学，２０１１，３２（１６）：２４９－２５２． 互作用的荧光光谱研究［Ｊ］．分析科学学报，２０１０，２６ ［１４］陈宗礼，贺晓龙，张向前，等．木枣ｎｔ－片、叶片愈伤组织 （１）：６７－７０． 及果实的氨基酸分析［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４（１０）： ［２２］Ｆａｒｉｄｂｏｄ Ｆ，Ｇａｎｊａｌｉ Ｍ Ｒ，Ｌａｒｉｊａｎｉ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ １９７．２０２． ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃ－ ［１５］朱燕舞，陈燕，姚昌中，等．同步导数荧光法测定食品 ｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ［Ｊ］．Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ Ａ， 中３种芳香族氨基酸［Ｊ］．理化检验：化学分册，２０１３， ２０１１，７８（１）：９６—１０１． ４９：１－５． ［２３］Ｍｏｔｅ Ｕ Ｓ，Ｂｈａｔｔａｒ Ｓ Ｌ，Ｐａｔｉｌ Ｓ Ｒ。ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅ． ［１６］张悦，马睿，赵冠超，等．同步荧光法对三种芳香族氨 ｔｗｃｅｎ ｆｅｌｏｄｉｐｉｎｅ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｎｌｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ 基酸的测定［Ｊ］．食品科学，２０１０，３１（１６）：２０４－２０７． ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，２０１０，２５（１）：１－８． ［１７］Ｈｕｎｇｅｒｆｏｒｄ Ｇ，Ｒｙｄｅｒｆｏｒｓ Ｌ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ Ｍ Ｊ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｏｎｅ— ［２４］Ｚｈａｎｇ Ｌｉｎａ，Ｗｕ Ｆａｎｇｙｉｎｇ，Ｌｉｕ Ａｉｈｏｎｇ．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ ａｎｄ ｔｗｏ－・ｐｈｏｔｏｎ ｔｉｍｅ・－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｌｅｕ・－ ａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ２，５－ｄｉ－［２－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｐｈｅｎｙ１）ｅｔｈｙｌｅｎｅ］一 ｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ一５，６－ｂｅｎｚｏｃｏｕｍａｒｉｎ ｃｏｎｊｕ－ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｏｎｉｔｒｉｌ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓ－ ｇａｔｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈ Ｐｈｏｔｏｂｉｏ Ａ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，２１５（２— ｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ Ａ，２０１１，７９ ３）：２１４－２２２． （１）：９７—１０３． ［１８］许倩影，刘忠芳，胡小莉，等．Ｐｄ（ＩＩ）与色氨酸，酪氨 ［２５］李晓燕．用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血 酸及苯丙氨酸相互作用的荧光光谱［Ｊ］．高等学校化 清白蛋白的相互作用［Ｊ］．物理化学学报，２００７。２３ 学学报，２０１ １，３２（７）：１４９２．１４９６． （２）：２６２－２６７． ［１９］Ｙｕ Ｘｉａｎｙｏｎｇ，Ｌｕ Ｓｈｉｙｕ，Ｙａｎｇ Ｙｉｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ （责任编辑李方）
