实验八 豌豆中蛋白质含量的测定
-----考马斯亮蓝G-250法
一 实验目的
1、学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 2、学会自己的设计实验
二 实验原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
三 实验器材
旋涡混合器、试管、吸管、722型分光光度计、容量瓶、电子分析天平等。
四 实验试剂
1、9％NaCL溶液。
2、标准蛋白母液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。
3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。以上试剂均为国产或进口分析纯。 4、标准液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，加入0.9%NaCl稀释至一定浓度。 5、样品液：精密称量5.0g研磨的豌豆干粉末，加入0.9%NaCl定容至50ml，备用。
五 实验方法
（一）标准曲线的制备
1、取6支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。
2、混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。
试剂 H2O/ml 管号 1（空白） 0 1.0 0 2 0.2 0.9 0.02 3 0.4 0.8 0.04 4 0.6 0.7 0.06 5 6 标准蛋白液/ml 0.8 1.0 8 0.08 0.4 1.0 蛋白质浓度（g/ml）
（二）样品的测定
1、样液的制备 取制备好的大豆组织样液1.0ml，加入0.9%NaCl定容至250ml，另取一支干净试管，加入样液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。 注意
2、含量的测定 经计算豌豆的0.0547mg/ml，及蛋白质的68.375%。
六 注意事项
1．研究表明，NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量干扰，可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min-1h内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定吸光度，因为在这段时间内颜色最稳定。
2．测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
3．待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100-800ug/ml为宜。
七 思考题
1． Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？
答: Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染
料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为 595 nm,蛋白质在 1～1 000 μg范围内,蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白 质的定量测定.
可以提高药品的纯度,设置对照,提高实验者的操作水平等来消除干扰,提高实验的精确性和可信度.
2.为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度？
答: 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法, 其适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，具有有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。估在实验前必须标定标准蛋白的纯度,以确保实验的准确. 八、参考文献
【1】胡志辉 种子蛋白质组分的综合实验设计. 江汉大学学报（自然科学版）.第38卷第2期.2010年6月
【2】董洁、郭力维等 中药水提取液中蛋白质含量测定研究.现代中药研究与实践.2009年第22卷第2期
【3】郭颖那、孙卫 蛋白质含量测定方法比较.河北化工.2008年04期第31卷第4期
【4】郭玉珍,陈庆富.染料结合法测定荞麦种子蛋白质含量的研究.广西植物Guihaia27(6)：952–957
【5】食黄婉玉等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量品与发酵工业.2009.35(5).160～163
【6】郭敏亮,姜涌明.考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响. 生物化学与生物物理进展.1996.23(6) ：558～561
附：原始数据：
试剂 H2O/ml 管号 1（空白） 0 1.0 0 2 0.2 0.9 0.02 3 0.4 0.8 0.04 4 0.6 0.7 0.06 5 6 标准蛋白液/ml 0.8 1.0 8 0.08 0.4 1.0 蛋白质浓度（g/ml） 豌豆稀释液的OD値三次分别为：0.305、0.309、0.0.300
