(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111420066 A(43)申请公布日 2020.07.17
(21)申请号 202010486829.2(22)申请日 2020.06.01
(71)申请人 江苏申基生物科技有限公司
地址 210000 江苏省南京市栖霞区仙林大
学城纬地路9号B6-2栋(72)发明人 童坤 肖潇 黄磊
(74)专利代理机构 南京中软知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 32466
代理人 郑燕飞(51)Int.Cl.
A61K 47/52(2017.01)A61K 31/713(2006.01)A61P 35/00(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图4页
(54)发明名称
一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法(57)摘要
本发明涉及本发明涉及基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法，在miRNA通过二硫键与碳点相连，利用细胞内外、癌细胞与正常细胞内还原性物种浓度差别，从而实现选择性的癌细胞内miRNA运输，利用输运体系在细胞外低浓度的还原性物种情况下miRNA释放速度慢，在癌细胞内还原性环境中miRNA释放速度快的特性，从而实现在癌细胞内的可控释放；同时，由于采用碳点作为载体，具有生物相容性好、尺寸小且均一、自身带有荧光易于追踪等优势；利用该递送系统可以高效的实现miRNA的细胞内运输，同时可以保持运输到细胞内的miRNA的生物活性。本发明的技术方案能够提供一种运载效率高、路径观察便捷且表征发挥好的基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法。
CN 111420066 ACN 111420066 A
权 利 要 求 书
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1.一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤S1：将miRNA的正义链与反义链均通过核酸合成仪进行合成处理，使炔键修饰的双链miR-34a负载到碳点表面，同时可还原性响应的释放，包括先合成一个两端分别带有叠氮与羧基，且中间为二硫键的一个连接子；
步骤S2：利用EDC作为缩合剂，在PBS中将氨基修饰的碳点与大过量的所述步骤S1中的连接子进行偶联，再通过超滤除去多余的小分子，超滤后待后续步骤使用；
步骤S3：通过Cu(I)催化的Click反应将所述步骤S2中已偶联上连接子的碳点与炔键修饰的双链miR-34a进行连接，最终构建得到该基于碳点的还原响应型miRNA输运系统。
2.根据权利要求1所述的一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的连接子是采用先通过二硫代二丙酸与1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷在1：1当量配比环境下缩合反应，并依次通过高效液相色谱以及冷冻干燥机进行纯化后得到的。
3.根据权利要求1所述的一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法，其特征在于：所述步骤S2中氨基修饰的碳点具体是采用将甘油与4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺（TTDDA）混合加热至220℃后，再加入柠檬酸，220 ℃保持4h，并经过透析以及超滤处理，最终得到氨基修饰碳点。
4.根据权利要求1所述的一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法，其特征在于：所述步骤S3中炔键修饰的双链miR-34a通过采用如下步骤获得，包括：
首先，进行miRNA的3’末端修饰，具体通过氨基树脂在核酸合成仪上固相合成3’氨基修饰的miRNA，再通过miRNA的3’末端氨基与炔基琥珀酰亚胺酯之间氨交换反应，得到3’炔键修饰的miR-34a，通过高效液相色谱以及冷冻干燥机对产物进行纯化；
然后，同样利用核酸合成仪合成miR-34a的反义链（antisense miR-34a），通过高效液相色谱以及冷冻干燥机对产物进行纯化后，与上一步骤中3’炔键修饰的miR-34a按照1:1的比例混合退火最终得到炔键修饰的双链miR-34a。
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一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法
技术领域
[0001]本发明涉及药物输运与可控释放技术领域，尤其涉及一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法。
背景技术
[0002]近年来，以miRNA为靶点的化学生物学研究也逐渐兴起，研究的重点大多集中在对miRNA的检测和上。人工合成的miRNA类似物（miRNA mimics）以及miRNA抑制剂（miRNA inhibitor）被证明是有效的生物体内miRNA水平的生物活性大分子，越来越多的应用在miRNA的人为以及创新研究当中。然而由于负电性影响，人工合成的miRNA类似物以及miRNA抑制剂自身很难通过细胞膜而进入到细胞内部，因此需要发展运输载体实现miRNA类似物以及miRNA抑制剂的细胞内运输。为此，全世界范围内的科研工作者们也开发出了多种方法，其中纳米材料由于具有较高的miRNA负载效率以及较高的运输效率因而受到了广泛的关注。很多纳米材料，例如介孔二氧化硅材料、量子点、碳纳米管等均被证明可以用于负载miRNA并将其运送到细胞内，有一些纳米材料已经开始应用在临床试验中。[0003]碳点（Carbon dots，C-dots）是一类尺寸较小（一般小于20 nm）的具有荧光性质的碳颗粒。作为一种新兴的纳米材料，碳点具有很多纳米材料所不具备的性质，例如：较小的尺寸、较高的生物相容性、较好的水分散性、自身的荧光性质、易于修饰的表面等，因此有潜力成为一种新型的RNA运输载体。Xiaoyuan Chen课题组2014年报道了一种具有双光子性质的碳纳米点载体，可在实现对DNA或者siRNA进行运输的同时实时观察运输载体的位置。Luc Lebeau课题组于2015年报道了一种碳纳米点，可以通过与pDNA的自组装从而实现了在动物水平向肺部有效运输pDNA的目的[23]。然而将碳点运用于miRNA的运输目前尚未见报道，基于前期对miRNA的3’端化学修饰的研究，结合碳点的性质，我们设计了一种还原响应型的miRNA输运体系。
发明内容
[0004]本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种运载效率高、运输路径观察便捷且表征发挥好的基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法。[0005]下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下:
miRNA是MicroRNA 的简称，属于一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子；
EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，是可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取；
PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用；
Cu(I)是指一价铜的化合物,Cu(II)的化合物主要是氧化物和氢氧化物,卤化物,硫化
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物,配合物等；
Click反应是指点击化学（Click chemistry），又译为“链接化学”、“速配接合组合式化学”，是由化学家巴里·夏普莱斯（K B Sharpless）在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成；
TTDDA是指4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺；为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案。
[0006]一种基于碳点的还原响应型miRNA输运系统合成构建方法，具体包括如下步骤：
步骤S1：将miRNA的正义链与反义链均通过核酸合成仪进行合成处理，使炔键修饰的双链miR-34a负载到碳点表面，同时可还原性响应的释放，包括先合成一个两端分别带有叠氮与羧基，且中间为二硫键的一个连接子；
步骤S2：利用EDC作为缩合剂，在PBS中将氨基修饰的碳点与大过量的所述步骤S1中的连接子进行偶联，再通过超滤除去多余的小分子，超滤后待后续步骤使用；
步骤S3：通过Cu(I)催化的Click反应将所述步骤S2中已偶联上连接子的碳点与炔键修饰的双链miR-34a进行连接，最终构建得到该基于碳点的还原响应型miRNA输运系统。[0007]作为本发明的进一步改进，所述步骤S1中的连接子是采用先通过二硫代二丙酸与1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷在1：1当量配比环境下缩合反应，并依次通过高效液相色谱以及冷冻干燥机进行纯化后得到的。[0008]作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中氨基修饰的碳点具体是采用将甘油与4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺（TTDDA）混合加热至220℃后，再加入柠檬酸，220 ℃保持4h，并经过透析以及超滤处理，最终得到氨基修饰碳点。[0009]作为本发明的进一步改进，所述步骤S3中炔键修饰的双链miR-34a通过采用如下步骤获得，包括：
首先，进行miRNA的3’末端修饰，具体通过氨基树脂在核酸合成仪上固相合成3’氨基修饰的miRNA，再通过miRNA的3’末端氨基与炔基琥珀酰亚胺酯之间氨交换反应，得到3’炔键修饰的miR-34a，通过高效液相色谱以及冷冻干燥机对产物进行纯化；
然后，同样利用核酸合成仪合成miR-34a的反义链（antisense miR-34a），通过高效液相色谱以及冷冻干燥机对产物进行纯化后，与上一步骤中3’炔键修饰的miR-34a按照1:1的比例混合退火最终得到炔键修饰的双链miR-34a。[0010]由于上述技术方案的运用，本技术方案具有的有益技术效果：
（1）本技术方案构建基于碳点的还原响应型miRNA运输体系，通过选择合成表面氨基修饰的碳点，一方面，由于氨基易于进行缩合反应从而可以进行后续的修饰，另一方面，修饰氨基的碳点表面带正电荷，更易进入细胞内；
（2）本技术方案展示了一种基于碳点的还原性响应的miRNA递送系统，利用该体系在细胞外低浓度的还原性物种情况下miRNA释放速度慢，在癌细胞内还原性环境中miRNA释放速度快的特性，从而实现在癌细胞内的可控释放；
（3）本技术方案同时采用碳点作为载体，具有生物相容性好、尺寸小且均一、自身带有荧光易于追踪等优势，我们发现利用该递送系统可以高效的实现miRNA的细胞内运输，同时可以保持运输到细胞内的miRNA的生物活性，便于进一步的探索集中利用该体系进行活体内miRNA的肿瘤细胞内高效精准运输；
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（4）本技术方案可通过紫外吸收光谱，发现碳点在300 nm-400 nm有吸收，随后采用405 nm波长的激发光激发碳点，通过荧光光谱，发现激发后的碳点产生了一个较宽的荧光发射峰，从450 nm到550 nm均有较强的荧光信号，这为后面实时观察碳点在细胞内的位置提供了便利；
（5）本技术方案还利用miRNA的3’末端氨基与炔基琥珀酰亚胺酯之间的氨交换反应，合成了3’炔键修饰的miR-34a，通过高效液相色谱以及冷冻干燥机对产物进行纯化，纯化后的3’炔键修饰的miR-34a可通过质谱进行表征，为实现对其表征效果验证提供了基础。附图说明
[0011]附图1为本发明基于碳点的还原响应型miRNA运输系统合成构建过程示意图；
附图2为本发明运输体系向细胞内运输miRNA的反应过程；附图3为本发明的连接分子合成过程示意图；附图4为本发明的3’炔键修饰miR-34a的合成过程示意图；附图5为本发明的3’Cy3修饰miR-34a反义链合成过程示意图；附图6为本发明的叠氮修饰碳点的合成过程示意图；
附图7为本发明负载有miR-34a的碳点的合成过程示意图。具体实施方式
[0012]下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。[0013]一、相关仪器与试剂
(1) 实验仪器核磁 (1HNMR和13CNMR)：400 MHz Bruker AVANCE III–400；紫外光谱检测仪器：岛津UV-3600紫外分光光度计；荧光光谱检测仪器：岛津RF-5301PC荧光光谱仪；Zeta电位以及DLS检测仪器：Brookhaven 90Plus动态光散射仪；TEM检测仪器：JEOL 2800高通量透射电镜；高分辨质谱检测仪器：Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS；高效液相分析色谱： Agilent 1200 测得；高效液相制备色谱：Waters 2535 LC；核酸合成仪：德国K&A系列DNA/RNA/LNA核酸合成仪；BioRad ChemiDoc MP凝胶成像系统；Leica TCS SP5双光子激光扫描共聚焦显微镜；Tanon 5200化学发光成像系统；Promega Glomax 20/20 Luminometer；ABI 7300 system实时荧光定量PCR系统。[0014](2) 实验试剂
化学品和溶剂均购自Sigma-Aldrich（Shanghai，China）；High Glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM），Fetal Bovine Serum（FBS），penincilin / streptomycin，Lipofectamine 2000, Taqman Probe, TRIZOL Reagent购自Thermo Fisher（Shanghai，China）；
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AMV酶、AMV Buffer、dNTP、rTaq酶、PCR Buffer、MgCl2 Buffer购自TaKaRa（Dalian, China）；
蛋白酶抑制剂混合物购自Cell Signaling（Shanghai，China）；荧光素酶测定试剂盒购自Promega（Beijing, China）；MTT购自Sigma-Aldrich（Shanghai，China）；SIRT1以及GAPDH抗体、Draq染料购自Abcam（Shanghai，China）。[0015]常规及特殊RNA单体、RNA树脂购自GenePharma（Suzhou, China）；
荧光素酶报告基因委托Genescript（Nanjing，China）进行构建；所有水溶液在使用前都用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。[0016]二、制备步骤方法
(1) 核酸合成
miRNA的正义链与反义链均通过核酸合成仪合成。当需要合成3’氨基修饰的miRNA时，采取固相合成载体为氨基修饰的CPG，将所需要合成的RNA序列输入仪器中，经过脱保护、活化、偶联、氧化四个步骤，便可得到合成好的miRNA树脂；将树脂取出，加入氨水和甲胺水溶液（比例1:1），室温下振摇2小时。[0017]高速离心后吸取上清液，浓缩抽干，加入脱2-TBDMS试剂（TEA·3HF：TEA：NMP=3：4：6），65 ℃水浴3.5小时；加入溶液体积4倍的预冷的正丁醇，混匀后置于-20 ℃中2小时以上，4℃ 高速离心10 min，收集沉淀物，沉淀物即为miRNA粗产品；随后采用高效液相色谱，采用DEPC水（100 mM醋酸铵）及乙腈作为流动相纯化得到高纯度miRNA，冻干后密封储存于-20 ℃。[0018](2) 氨基修饰碳点的合成
取1g TTDDA与15 mL丙三醇混合均匀，在氮气保护的条件下升温至220 ℃，快速向该混合液中加入1g柠檬酸，保持220 ℃，4 h后冷却至室温；采用截留分子量为3K的透析袋透析48 h后，再过0.22μm的滤膜，取滤液再经由3kD超滤管超滤浓缩，最终得到氨基修饰碳点。[0019](3) 连接分子的合成（合成过程如附图3）
将二硫代二丙酸（252 mg, 1.2 mmol）与1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷（218 mg, 1.0 mmol）溶于DMSO中，加入HBTU（379 mg, 1.0 mmol）与DIEA（700 μL, 4.0 mmol），室温搅拌2 h后，将反应液用高效液相色谱分离，流动相为乙腈（0.1% TFA）以及水（0.1% TFA），将收集到的液体冻干获得118 mg化合物1a。[0020](4) 核酸修饰（3’炔键修饰miR-34a的合成过程如附图4）
取10 nmol 3’氨基修饰的miR-34a正义链，溶于DMSO中，加入过量化合物1b（128.5 μg, 500 nmol）及DIEA（总体积的10%），室温搅拌过夜，将反应液用高效液相色谱分离，采用DEPC水（100 mM醋酸铵）及乙腈作为流动相纯化得到炔键修饰的miR-34a正义链3.7 nmol。Q-TOF LC/MS质谱检测仪器的计算值：7398[M+H]+（质子化分子离子）, 实测值7398。[0021]3’Cy3修饰miR-34a反义链的合成，如附图5所示，取10 nmol 3’氨基修饰的miR-34a反义链，溶于DMSO中，加入过量Cy3-NHS（278 μg, 500 nmol）及DIEA（总体积的10%），室温搅拌过夜，将反应液用高效液相色谱分离，采用DEPC水（100 mM醋酸铵）及乙腈作为流动相纯化得到Cy3修饰的miR-34a反义链2.6 nmol。Q-TOF LC/MS质谱检测仪器的计算值：7594[M+H]+（质子化分子离子）, 实测值7594。
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(5) miRNA装载
叠氮修饰碳点的合成如附图6所示，取10 mg 氨基修饰的碳点溶于PBS中，加入过量化合物1c（20 mg, 0.05 mmol）及EDC（38.2 mg, 0.2 mmol）室温下搅拌反应2 h后超滤除去多余的小分子。
[0023]负载有miR-34a的碳点的合成如附图7所示，取2 nmol 3’炔键修饰的miR-34a正义链与2 nmol miR-34a反义链，溶于DEPC水中，99 ℃加热2 min后，缓慢冷却至室温并室温放置2 h，将退火形成的双链miR-34a与叠氮修饰的碳点按照1/40的质量比混合均匀，加入3.2 mg硫酸铜，20 mg VC以及5 mg THPTA混匀后室温搅拌反应2 h，超滤除去多余小分子以及未反应的miR-34a即可获得装载有miR-34a的碳点。[0024]以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
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